【www.zhangdahai.com--试用期工作总结】
【摘要】 目的 观察大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)后脊髓背角P物质表达的变化，探讨P物质在疼痛发生机制中的作用。方法 SD雄性大鼠60只,随机分为:A组：CCI组(30只)； B组：对照组(30只)。术前及术后3、7、14、28 d分别测定大鼠热痛阈值、机械痛阈值和行为学评分。术后3、7、14、28 d每组取4只，麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定，取L��4-6�段脊髓，以备免疫组化，测定SP的变化。结果 所有CCI动物从术后第3天起,出现明显的疼痛行为学改变和热痛阈值、机械痛阈值的降低，与对照组比较差异有统计学意义(P[1] 。P物质(substance P,SP)是速激肽家族中重要一员，广泛分布于中枢神经系统和外周组织中。在脊髓，P物质是公认的与伤害性信息传导密切相关的神经活性物质[2]，本实验旨在观察坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)后大鼠痛行为学改变和脊髓背角SP 含量变化,探讨SP 在CCI后可能的作用。�
1 材料与方法�
1．1 对象 本实验在郧阳医学院实验中心及动物中心完成。成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(郧阳医学院实验动物中心提供)，体质量150~200 g。�
1．2 CCI［坐骨神经慢性压迫性损伤］模型的建立 按Bennett 等的方法,SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉(30~40 mg/kg)后,常规消毒右下肢,找到坐骨神经主干,用4-0铬制羊肠线松扎四处,间距为1 mm,结扎线以不影响神经外膜的血运为度。术毕立即腹腔注射青霉素20万U。�
1．3 动物分组及观察指标 SD雄性大鼠60只,随机分为:A组：CCI组(30只)； B组：对照组(30只)，对照组除坐骨神经不结扎外，其他操作同CCI动物。�
观察指标：于术前、术后3、7、14、28 d 测定大鼠热痛阈、机械痛阈值及行为学评分。于术后3、7、14、28 d 每组取3只，麻醉后麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定，取L��4-6�段脊髓，以备免疫组化，测定SP的变化。�
1．4 动物疼痛行为学测定�
1．4．1 整体行为学评分 参照Attal等的评分方法,通过观察动物行为及损伤侧爪部姿势判断自发性疼痛程度。�
1．4．2 机械痛阈的测定 采用YLS-3E 电子压痛仪(正华公司,中国)测定双后肢机械痛阈。设定增量压力10 g/s。大鼠放在有机玻璃框架中,待鼠安静,探针对准大鼠后足掌心，启动开始键，至大鼠嘶叫，记录该刻值，即为机械痛阈阈值。术侧与健侧各测量5次,每次间隔5 min，取平均值。�
1．4．3 热痛阈的测定 采用ZH-LUO/B辐射光热测痛仪(正华公司,中国)测定大鼠足底热痛阈。设定辐射热强度：49 I.R；实际照度：180 mW。记录辐射照射开始到抬足的时间，该时间即为热痛阈。单次光照射时间不超过30 s，间隔5 min，术侧与健侧各测定5次，取平均值。�
1．5 脊髓背角SP的免疫组织化学测定及分析
①石蜡冠状切片，脱蜡入水，3％H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗3 min×3次；
②微波炉(中档)修复3 min，室温冷却60 min，蒸馏水洗3 min×3次，0．01 mol/L,pH 7．4 PBS漂洗3 min×3次 ；
③滴加 3％H2O2 水溶液，室温15 min，蒸馏水洗3 min×3次，0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次 ；
④滴加30 μl正常羊血清，室温孵育15 min；
⑤甩掉血清，滴加30 μl 1:100 SP抗体，空白对照片加30 μl抗体缓冲稀释夜,湿盒内4℃过夜；
⑥0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次；
⑦滴加链霉卵白素-辣根过氧化物酶(HRP-Streptavidin)，室温孵育15 min；
⑧0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次；
⑨DAB溶液(用前现配)染色3~5 min；
⑩自来水充分冲洗；
�B11�苏木素复染1~2 min；
�B12�自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；
�B13�应用Geica QwinV3图像分析系统进行计算机图像分析处理，选用免疫阳性反应物的累积光密度值进行统计分析。�
1．6 统计学方法 用Excel和SPSSv13．0软件进行统计学分析，实验结果以均数±标准差”(x±s)表示。组间比较采用成组t检验，组内比较用配对t检验进行分析，P[2]，含有它们的初级神经纤维及末梢主要终止于脊髓背角浅层，并与接受伤害性刺激的投射神经元形成直接或间接的联系[3]。SP不仅传递伤害性信息,而且在脊髓痛觉调制中具有重要作用[4]，它与兴奋性氨基酸一起介导伤害性初级传入向脊髓背角的传递[5]，近年来体微电极技术可精确定位刺激引起的SP在脊髓背角释放[6]。Yezierski [7]等证明SP与脊髓损伤后的中枢性疼痛有关。在活体，激活了C纤维后，许多神经肽类物质释放，如SP、CGRP、血管活性肠肽VIP、生长抑素和谷氨酸[8]，这些递质递质作用于受体后，改变疼痛行为。SP作用于突触后膜NK1受体，加强伤害性信号传递。神经激肽NK1与NK�2受体是伤害感受中最重要的受体[9],当脊髓内同时注射SP和谷氨酸时，产生显著的，相互增强的致痛反应[10]。神经损伤后，C纤维兴奋性增加，SP大量释放，作用于脊髓背角的NK1受体，NK1受体激活后，激活磷脂酶C，使细胞内的三磷酸肌醇IP3和二酰基甘油DAG的浓度增加。IP3动员内质网内的Ca2+储库，使细胞内游离Ca2+的浓度增加,使NMDA受体激活。在L5、L6脊神经结扎前、后损伤NK1受体表达神经元，能减轻神经源性痛，说明NK1受体神经元参与背角神经元的敏化[11]。�
外周神经损伤常引起慢性神经病理性疼痛，表现为持续自发性疼痛和痛觉过敏，外周和中枢的敏化是其病理基础。本研究显示CCI大鼠于术后3 d出现疼痛行为学变化和热刺激痛觉过敏、机械性痛敏，7 d达高峰，在后续较长的时间内维持稳定，表明形成了较为典型的神经病理性痛；在疼痛产生的不同时间点，观察SP的表达变化，本研究发现CCI后术侧脊髓背角SP与对照组比均明显升高，术侧明显高于健侧(P ［5］ Millan MJ.The induction of pain:an integrative review.Prog Neurobiol,1999,57:121461.�
［6］ Zhao ZQ,Yang HQ,Zhang KW,et al.Release and dep letion of substance P by cap saicin in substantia gelationosa studeide with the antibody icrop robe technique and immunohistochemistry.Neuropeptides,1992,23:161-1671.�
［7］ Yezierski RP,Yu CG,Mantyh PW,et al．Spinal neurous involved in the generation of at-level pain following spinal injury in the rat.Neurosci Lett,2004,361(1-3):232-261.�
［8］ Morton CR,Hutchinson WD.Morphine does not reduce the intraspinal release of calcitonin gene-related peptide in the cat.Neuroscience Letters,1990,117:319-324.�
［9］ Fleetwood-Walker SM,Hope PJ,Mitchell R,et al.The influence of opioid receptor subtypes on the processing of nociceptive inputs in the spinal dorsal horn of the cat.Brain Research,1988,451:213-226.�
［10］ Mjellem-Joly N,Lund A,Berge OG,et al.Potentiation of a behavioural response in mice by spinal coadministration of substance P and excitatory amino acid agonists.Neuroscience Letters,1991,133:121-124.�
［11］ Nichols ML,Allen BJ,Rogers SD,et al.Transmission of chronic nociception by spinal neurons expressing the substance P receptor.Science,1999,286:1558-1561.�
