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【摘要】 目的 观察沙立度胺对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖的抑制作用。方法 设置溶剂对照及沙立度胺不同浓度组、时间组，采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 法检测各组细胞存活和生长情况，分析量效关系、时效关系。结果 ① 在10～200 μg/ml浓度范围，沙立度胺对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖均有抑制作用。在药物作用48 h后各组的细胞抑制率均达到高峰，48 h时又以100 μg/ml浓度组抑制率最高。结论 在一定浓度范围，沙立度胺对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖具有抑制作用。
【关键词】乳腺肿瘤；细胞系；沙立度胺；MTT
Studies on MTT colorimetric assay on the effect of thalidomide on proliferation of breast cancer cell
YANG Zhi-yong，Li Shu-qin,JI Yan-xia，et al.Handan Central Hospital,Handan Hebei Province 056001,China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of thalidomide on proliferation in breast cancer cell lines.Methods Establishing the melting agent checks against and different density，establishing different times at the same time,in order to observes the relation between time and efficacy,the growth rate among these groups was detected by MTT assay.Results The growth rate in these groups had differences,thalidomide can inhibit the proliferation of MCF-7 and MDA-MB-231 among 10-200 μg/ml.The beast inhibitory effect is occurring after thalidomide treated 48 h.100 μg/ml have the beast inhibitory effect after treated 48 h.Conclusion Thalidomide could inhibit the proliferation of breast cancer cells.
【Key words】Breast cancer;Cell lines;Thalidomide;MTT
通过体外实验观察沙立度胺对乳腺癌细胞增殖的影响，为沙立度胺在肿瘤治疗中的应用提供实验资料。
1 材料与方法
1．1 细胞株与材料 人乳腺癌细胞由河北医科大学附属第四医院科研中心保存。沙立度胺（±）Thalidomide，Sigma公司产品，批号093K461。溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成50 mg/ml浓度储存备用。MTT(四甲基偶氮唑蓝)为华美生物工程公司产品。
1．2 细胞培养 将MDA-MB-231、MCF-7细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中(pH 7．2～7．4)，在37℃、5% CO2和饱和湿度条件下培养。细胞呈贴壁生长，待其铺满瓶壁时以0．25% 胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。
1．3 MTT法检测细胞增殖反应 将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μl 含1×10�4个细胞，置于CO2培养箱中，37℃培养24 h，待细胞附壁后小心吸出各孔内培养液，设置溶剂对照组及4个含沙立度胺（10、50 、100、200 μg/ml）的DMEM培养液组，控制溶剂终浓度2培养箱中，37℃继续培养，培养结束前4 h，各培养孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl，4 h后，弃上清液，每孔加入10%DMSO 100 μl，震荡10 min后，用全自动酶标仪检测各孔A570 nm的OD值（OD570 nm），以不加药的阴性对照组A570的OD值均数作为对照，上述实验重复3次。细胞抑制率CI(cytotoxic index,毒性指数)用下式计算： CI(%)=(1-试验组OD值/对照组OD值)×100%。抑制率正值表示对细胞有杀伤作用，负值表示对细胞有促增殖作用。
1．4 统计学方法 数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS10．0软件对所有数据进行统计学处理。各组的组间均数比较用方差分析，以α=0．05为检验水准。
2 结果
沙立度胺对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的影响结果见表1～4。沙立度胺各组对MCF-7和MDA-MB-231细胞均有明显的抑制作用，同一药物浓度组作用24、48 、72 h 3个时间点，以48 h抑制率最高。不同浓度组作用48 h，以100 μg/ml组抑制率最高。
3 讨论
沙立度胺化学名称是N-(2,6-二氧-3-哌啶基)-邻苯二甲酰亚胺或2-(2,6-二氧-3-哌啶基)1H-异吲哚-1,3-(2H)-二酮[1]。近几年因其具有抗肿瘤作用应用于临床抗肿瘤治疗，但其抗瘤谱、最佳有效剂量、给药方式以及最佳的联合治疗方案，均有待进一步研究，作用机制亦不甚明了。本文从基础实验角度观察了沙立度胺对乳腺癌细胞的影响，并初步探讨了部分作用机制。
我们采用MTT法来观察了沙立度胺对乳腺癌细胞增殖的影响，结果表明其药理效应与剂量在一定范围内存在剂量-效应关系，但是超过此范围（200 μg/ml），继续增加浓度而效应不再继续增强。我们再进一步分析MTT所测的各组抑制率数值，发现沙立度胺的半数细胞增殖抑制浓度(inhibitory concentration giving 50% inhibition，IC50)接近50 μg/ml，远大于20 μg/ml，而按照标准IC50[2]。既然不能判定沙立度胺对乳腺癌细胞有杀伤作用，那么它是通过哪些机制来抑制乳腺癌细胞增殖的呢？已有报道沙立度胺可以诱导细胞凋亡并且抑制血管内皮生长因子的重要的促细胞生长因子[3]，我们将在后续的实验中进一步探寻其抑制乳腺癌细胞增殖的机制。
本实验结果表明沙立度胺在一定浓度范围内可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖，而且该抑制作用并不受细胞雌孕激素受体（ER、PR）状态的影响（MCF-7 细胞ER、PR阳性而MDA-MB-231细胞ER、PR阴性），这对于ER和PR阴性，或内分泌治疗效果差的乳腺癌患者来讲，无疑是一个有吸引力的治疗手段。目前沙立度胺由Commercially available研究机构用于乳腺癌临床Ⅱ期，可望和传统的细胞毒药物相结合，成为现有乳腺癌治疗手段的良好补充。
参考文献
1 Peuckmann V,Fisch M,Bruera E.Potential novel uses of thalidomide:focus on palliative care.Drugs,2000,60:273-292.
2 张均田.现代药理实验方法.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998:818.
3 Hideshima T,Chauhan D,Shima Y,et al.Thalidomide and its analogs overcome drug resistance of human multiplemyelo maceloma cells to conventional therapy.Blood,2000,96(9):2943-2950.
