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【摘要】本实验采用MTT法检测了不同浓度的大豆异黄酮对人成骨肉瘤细胞株MG-63增殖活性的影响。结果表明大豆异黄酮可以抑制MG-63细胞的增殖，具有剂量效应关系。 【关键词】MTT，大豆异黄酮，MG-63细胞
【Abstract】To determine the effects of soy isoflavone on the growth of human cell line MG-63, the cells were treated by different concentrations of soy isoflavone for 48h then MTT assay were performed to observe the effects of soy isoflavone on cell proliferation. The results showed that soy isoflavone markedly inhibited the proliferation of MG-63 cell in dose-dependent manner.
1前言
女性从成熟走向衰退的过程中，45岁以后卵巢功能会逐渐退化，雌激素分泌减少，血液雌激素水平下降，会引起一系列包括骨质疏松在内的更年期综合征。为缓解这一症状，医学上引入了雌激素替代疗法[1]，植物雌激素因为副作用小而在雌激素替代疗法中得到广泛应用，成为了相对于人工合成药品而言的天然雌激素替代品，在预防和治疗妇女更年期综合症方面受到人们越来越多的关注。日常饮食中所包含的植物雌激素主要有异黄酮类和木质素等等，其中大豆异黄酮最为广泛存在，生产生活中为人们广泛接触。大豆异黄酮主要存在于豆类作物[2]，具有较高生物活性，许多实验研究证明大豆异黄酮具有抗肿瘤，防止骨质疏松症，改善妇女更年期障碍，防治心血管疾病等多种生理功能[3-5]。因此，研究大豆异黄酮对人成骨肉瘤细胞增殖活性的影响在研究防治骨质疏松和大豆异黄酮的抗肿瘤活性两个方面具有重要意义
2材料与方法
2.1细胞株人成骨样细胞MG-63购自中国医学科学院细胞库，37℃、5%CO2含10%胎牛血清DMEM培养基培养，贴壁生长，药物暴露细胞时选择无酚红DMEM培养基加10%活性炭处理的胎牛血清进行培养.
2.2主要试剂与仪器大豆异黄酮、DMEM培养基、胰酶、特级胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，细胞培养瓶及24孔培养板购自Coring公司，细胞培养箱为SANYO公司生产，细胞检测仪为德国CACS公司生产；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜均（DMSO）购自Sigma公司.
2.3实验方法
2.3.1药物的配制配制大豆异黄酮终浓度为2mg/ml DMSO储存液，4℃冰箱中保存备用.实验时分别依次梯度稀释成1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml.称取0.05g MTT溶于10ml PBS中，过滤除菌，避光保存于4℃冰箱，两周内有效。
2.3.2活性炭吸附处理胎牛血清将活性炭冲洗干净并烘干灭菌，在胎牛血清FBS中加活性炭 250mg/100ml，55℃水浴1h，3000rpm离心l0min提取上清液。连续处理2次以除去血清中的内源性雌激素。处理后的血清用一次性滤器(0.22μm)过滤除菌，-20℃保存备用。
2.3.3MTT法测细胞增殖效应取生长旺盛的MG-63细胞进行胰酶消化，离心收集细胞，完全培养基稀释后以2×104细胞/ml/孔的密度接种于24孔板，正常培养24 h后，PBS洗去未贴壁细胞。培养液更换为无酚红DMEM培养液加10%活性炭处理胎牛血清，设空白对照组(培养液)、溶剂对照组(培养液+细胞+DMSO)和不同浓度实验组(培养液+细胞+大豆异黄酮)。每个浓度组设三个复孔，对照组不加药物，37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养48小时之后，每孔加100ulMTT (浓度5mg/ml)，继续培养4小时后弃去培养液，每孔加入1ml的DMSO溶液溶解振荡10分钟，放入酶标仪中在490nm波长检测光密度值(optical density，OD)。
3实验结果
大豆异黄酮对人成骨肉瘤细胞MG-63增殖活性的影响结果见图一
图一大豆异黄酮作用前后MG-63增殖活性的变化
由图一可见，随着大豆异黄酮浓度的升高，成骨肉瘤细胞MG-63在490nm处的吸光值逐渐减少，即细胞数量逐渐减少，可见大豆异黄酮对成骨肉瘤细胞MG-63的增殖具有抑制作用。
图二大豆异黄酮对MG-63细胞增殖抑制率的影响
由图二可见，随着大豆异黄酮浓度的升高，对成骨瘤细胞MG-63的增殖抑制率逐渐升高，具有浓度梯度效应，即随着大豆异黄酮浓度的升高，其抑制成骨肉瘤细胞增殖的效应越强，细胞的增殖抑制率越高。
4结论
大豆异黄酮作为大豆类产品的有效提取物，具有抗成骨肉瘤细胞MG-63增殖的作用，说明大豆异黄酮具有一定的抗肿瘤活性。
5讨论
体外细胞培养技术作为一种较为常用的实验检测手段，自创立以来几乎已经被应用到生物和医学等研究的各个领域。进行体外细胞培养不仅可以认识细胞表面特征，而且是医药研究，特别是肿瘤疾病及抗肿瘤药物的筛选的重要技术。大豆异黄酮作为天然的植物雌激素在日常生产生活中被人类广泛接触，自从人们发现大豆异黄酮植物雌激素具有抗肿瘤效应以来，在各种肿瘤的防治中对其进行了大量的研究[6,7]。流行病学调查和体内外试验研究的结果都表明大豆异黄酮可以抑制乳腺癌细胞的生长，对乳腺肿瘤具有一定的防治作用，大豆异黄酮对乳腺癌细胞生长的作用主要表现为增殖抑制效应[8-10]，并且大豆异黄酮对结肠癌也有抑制作用[11]。成骨肉瘤是一种恶性肿瘤而且关于大豆异黄酮对成骨肉瘤细胞增殖活性的研究较少，曾经有研究表明大豆异黄酮可以增加大鼠的骨质密度[12]，本实验利用体外细胞增殖实验使用MTT方法检测了大豆异黄酮对MG-63细胞增殖活性的影响，结果表明大豆异黄酮可以显著抑制MG-63细胞的增殖，这点提示大豆异黄酮在成骨肉瘤的防治方面具有一定的应用价值，提高大豆及其制品的摄入量对人体的健康是有益的，同时展现了大豆异黄酮在保健食品和食品添加剂的研发上良好的应用前景。关于大豆异黄酮抑制成骨肉瘤细胞MG-63增殖活性的机制需要进一步研究。
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