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【关键词】STARD7;载体构建;转染 doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.010 文章编号:1006-1959(2010)-05-1035-02
SATRD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。START涉及脂类结合介导的细胞信号转导、脂类转运和调节。START发生突变或错误表达与基因错配、自身免疫性疾病以及肿瘤相关。为了研究STARD7基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响,我们将STARD7基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定转染到HEPG1*2肝癌细胞中。
1.材料和方法
1.1 材料:大肠杆菌DH-5α和人肝癌细胞系HepG1*2均由本实验室保存,pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司,M-MLV逆转录酶购自Promega公司,各种分子克隆工具酶购自MBI公司,脂质体Lipofectamine2000、Trizol试剂、G418和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司,RPMI1640、胎牛血清(FBS)等购自GIBCOBRL公司。
1.2 方法。
1.2.1 HepG1*2总RNA的提取。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的HepG1*2,加TRIZOL试剂1mL,静置3~5min。加入氯仿0.5ml,混匀。室温静置2~3min后,12000r/min离心15min。于上清中加人0.5ml异丙醇,室温静置10min。10000r/min离心10min。弃上清,加入750ml/L乙醇1ml,7500r/min离心5min,干燥沉淀,加入30μL DEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后,用紫外分光光度计测定其纯度并定量,保存于-80℃备用。
1.2.2 引物设计。根据GenBank的基因序列(NM_064536),设计扩增STARD7编码区cDNA上、下游引物。上、下游引物中分别引入SamⅠ、Xhol酶切位点,扩增片段为880bp。上游5" CTCGAGATGGCGGCGTTAGCC 3",下游5" CCCGGGAGCATACTCAATC 3";内参照β-actin的引物序列为:上游5" TGTGACGTGGACATCCGCAAAG 3",下游5" TGGAAGGTGGACAGCGAGGC 3",扩增片段为206bp。并设计作为转染HepG1*2细胞后鉴定用的G418抗性基因PGK neo的特异性引物:上游5"-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG 3",下游5"-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG 3",扩增片段为492bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。
1.2.3 逆转录合成cDNA逆转录。反应体系为:细胞总RNA 1μg,H2O 13μL,oligdT 0.5μg,70℃ 5min,立刻冰上放置,加入M-MLV 200u,dNTP 10nmol,5×M-MLV Buffer 5μL,Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 25u,混匀后42℃ 1h,70℃ 10min。取10μL反转录产物进行PCR反应,采用降落PCR(Touch down_PCR),反应条件:94℃预变性4min;94℃变性30s,63℃退火30s,72℃延伸40s扩增35个循环,72℃延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收目的片段。
1.2.4 T载体克隆。对PCR产物进行割胶纯化,将目的片段与pMD18-T载体连接。连接反应体系为:Solution I 5μL,pMD18-T DNA 50ng,PCR产物50ng,ddH2O 3μL,置于16℃ 2h后,连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态,在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长,挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定,并命名为:pMD18-T/STARD7。
1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1(-)/STARD7的构建用Sam I、Xho I分别双酶切重组pMD18-T/STARD7质粒及pcDNA3.1(-)空载体,凝胶电泳后回收目的片段,16℃连接10h。连接、转化,方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序正确后扩大培养,抽提重组质粒DNA。
1.2.6 细胞培养。HepG1*2细胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中,于37℃、50mL/LCO2饱和湿度的孵箱中培养。
1.2.7 HepG1*2细胞的基因转染和筛选培养。将处于对数生长期的HepG1*2细胞以4×105个细胞/孔接种于六孔板中,培养24h,使细胞达到80%～90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前1h先予细胞更换无血清培养基,使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液,A液:4μg质粒DNA溶于150μL无血清培养液中;B液:4μL脂质体溶于150μL无血清培养液中。将A液与B液混匀,室温孵育30min,以形成DNA-脂质体复合体,加入培养液中。培养8~14h,更换为完全培养液,继续培养24h,次日于完全培养液中加入800mg/L的G418继续进行培养,2周后G418浓度改为400mg/L维持筛选。用选择培养液培养4周后,分离阳性克隆并扩大培养备用。
1.2.8 转染后STARD7表达的鉴定。分别以β-actin为内参照,对STARD7基因在转染细胞内目的基因的mRNA及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转染空载体重组质粒的细胞,样品处理后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、TBST缓冲液洗膜、50g/L脱脂牛奶封闭。一抗为STARD7小鼠多抗,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,ECL显色。
2.结果
2.1 总RNA提取。用一步法成功提取HepG1*2总RNA,总RNA电泳结果可见有5S、18S和28S三条带。
2.2 RT-PCR扩增产物的鉴定及真核表达载体的构建与鉴定。HepG1*2总RNA经RT-PCR扩增,扩增产物电泳结果可见在约880bp处有一特异性扩增条带(图2),与预期的扩增片段大小相符。将用SamI、Xho I双酶切重组质粒pMD18-T/STARD7得到的目的基因插入pcDNA 3.1(-)空质粒,获得pcDNA3.1(-)/STARD7真核表达质粒,该质粒再经SamI、Xho I双酶切鉴定,得到了880bp的目的片段和约5400bp的载体片段(图1),送测序证实该质粒含有完全正确的STARD7 cDNA序列。
图1 RT-PCR扩增产物及重组质粒pcDNA3.1(-)/STARD7双酶切鉴定
M:DL2000 DNA marker;1:pcDNA3.1(-);2:pcDNA3.1(-)/STARD7;3:STARD7 RT-PCR扩增产物。
2.3 稳定表达株的筛选与鉴定。将pcDNA3.1(-)/STARD7质粒转染入人肝癌细胞系HepG1*2,经4周选择性培养(400mg/LG418)后,得到了稳定表达目的基因mRNA的阳性细胞株。采用STARD7半定量引物进行RT-PCR扩增,在采用G418抗性基因PGK neo引物进行的扩增中,转染pcDNA3.1(-)/STARD7及pcDNA3.1(-)空载体的HepG1*2细胞均得到一条大小为492bp的PGK neo条带,而未转染的HepG1*2细胞没有扩增出该条带,说明pcDNA3.1(-)空载体和pcDNA3.1(-)/STARD7均已转入到HEPG1*2细胞中(图2)。筛选后的STARD7稳定表达细胞经RT-PCR及Western blot方法分析,转染了pcDNA3.1(-)/STARD7的HEPG1*2细胞与对照转染空载体及未转染的HepG1*2细胞相比,转染了pcDNA3.1(-)/STARD7的HepG1*2细胞扩增后的STARD7目的条带明显比对照转染空载体的亮,说明重组子已成功转入HepG1*2细胞并得到表达(图3、4)。
1:HepG1*2;2:HepG1*2/pcDNA3.1(-); 3:HepG1*2/pcDNA3.1(-)/STARD7:M:DL2000
图2 pcDNA3.1(-)/STARD7重组细胞G418鉴定图
Fig 2.Identification of G418 in reconstituted cell pcDNA3.1(-)/STARD7
M:DL 2000;1:HepG1*2;2:HepG1*2/pcDNA3.1(-);3:HepG1*2/pcDNA3.1(-)/STARD7
图3 各转染组细胞STARD7基因的mRNA水平变化
Fig 3 Expression of STARD7 mRNA in different transfected cells
1,2:转染空载体的HepG1*2细胞;3,4:转染STARD7的HepG1*2细胞
图4 Western-blot检测重组细胞STARD7表达
Fig.4 The expression of STARD7 transfected with HepG1*2
3.讨论
STARD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。为进一步研究STARD7过表达后对肿瘤细胞的生物学功能的影响,在本实验中我们将此基因构建在真核细胞表达载体pcDNA3.1(-),经限制性核酸内切酶酶切鉴定、测序证实目的基因STARD7序列正确,成功构建重组子pcDNA/STARD7。然后将所构建的含STARD7基因的重组质粒转染到HepG1*2细胞,并用G418筛选稳定转染细胞株,选择抗性克隆,将新的克隆细胞挑选出扩大培养。为了鉴定STARD7基因是否已经转染到HepG1*2细胞中,我们通过扩增G418抗性基因PGKneo序列来鉴定,因为pcDNA3.1(-)中带有G418抗性基因PGKneo,该序列是很特异的,人的HepG1*2细胞中不含有该序列,如果没有转染的细胞,那么就扩增不出492bp的特异条带。而且转染了STARD7基因的HepG1*2细胞,其STARD7目的条带比转染了空质粒的HepG1*2及未转染的HepG1*2细胞在mRNA水平及蛋白水平表达量均增加,表明STARD7基因已经转染到HepG1*2细胞中并且有此蛋白的过量表达。本实验为进一步研究STARD7基因对肿瘤细胞的生物学功能的影响奠定了实验基础。
参考文献
[1] John Colicelli.Human RAS Superfamily Proteins and Related GTPases[J].Sci.STKE,2004,(250),re13.
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[3] Gary Oxford,Charles R,Owens,Brian J,Titus,Tonia L,Foreman,et.al.RalA and STARD7:Antagonistic Relatives in Cancer Cell Migration[J].Cancer Res,2005,65:(16).August 15,2005.
