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【摘要】 目的 建立HPLC法测华法林片的含量。方法 采用Diamonsil C18(4．6 mm×250 mm,5 μm)为分离柱；流动相：乙腈-水-冰醋酸(70∶30∶1)；流速：1 ml/min；检测波长308 nm，以峰面积计算。结果 线性范围：0．8~5．6 μg/ml，r=0．999 6。平均回收率为100．64%，RSD=1．11%,n=15。结论 本法简便，快捷，结果准确，重现性好，可作为华法林片质量控制的有效方法。�
【关键词】High performance liguid chromatography
；华法林；含量测定
Determination of warfarin in tablets by HPLC
HUANG Bi-ying,YAO Qiu-yan,LI Min-wei,et al.Dept of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangdong,Guangzhou 510080，China
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【Abstract】 Objective To establish a HPLC method to measure the content of warfarin tablets.Methods A Diamonsil C18column(4．6 mm×250 mm,5 μm)was used.The mobile phase was a mixture of 70%acetonitrile,30%water and 1%glacial acetic acid,and the flow rate was 1．0ml/min.The detection wavelength was at 308 nm.Results The linear calibration curves were obtained over the range 0．8 μg/mlto 5．6 μg/ml of warfarin,r=0．999 6．The recovery of the assay was 100．64%(n=15).The coefficients of variation was 1．11%.Conclusion The method appeared to be simple,convenient and precise,and can be used for control of warfarinin tablets.�
【Key words】HPLC；Warfarin；Determination
华法林(warfarin)为香豆素类口服抗凝药，化学结构与维生素K相似，可竞争性拮抗维生素K的作用。临床上用于防治血栓栓塞性疾病及作为心肌梗死的辅助用药[1]。本文参考文献[2]建立了HPLC法测定华法林的含量，试验结果表明，该法简便，快捷，准确，重现性好。
1 仪器和试药
1．1 仪器 美国Waters公司高效液相色谱仪(515型泵，996型光电二极管阵列检测器，Millennium32色谱工作站)；AG245电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SHZ-C水浴恒温振荡器；高速离心机(美国雅培公司TDx仪附件)。
1．2 试药 华法林国产市售片(上海信宜九福药业有限公司，2．5 mg/片，批号分别为A：050401，B：050301)；华法林进口片(芬兰奥立安药厂，3 mg/片，C：批号为1084667)；华法林对照品(SIGMA公司，纯度98%)；所用试剂乙腈为色谱纯，其余均为分析纯，水为二次重蒸馏水。
2 色谱条件与系统适用性�
色谱柱：Diamonsil C18(4．6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水-冰醋酸(70∶30∶1)；流速：1．0 ml/min；柱温：室温；检测波长308 nm；进样量20 μl。在上述色谱条件下，以华法林计算，理论塔板数为4780，分离度>3，主峰保留时间为5．8 min。
3 溶液配制
3．1 对照品储备液 精密称取华法林对照品约250 mg置于25 ml容量瓶中，加0．1 mol/L氢氧化钠溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，配成10 mg/ml的华法林对照品储备液。
3．2 供试品溶液 分别取样品20片，精密称定，研细，混匀。精密称取适量(约相当于华法林2．5 mg)，置于50 ml容量瓶中，加入0．1 mol/L氢氧化钠溶液25 ml，水浴(28℃)振荡30 min使溶解，定容，离心(10 800 r/min)5 min，上清液用微孔滤膜滤过，精密量取续滤液1 ml于25 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成供试品溶液。
3．3 阴性对照品溶液 按华法林片的处方自制空白样品，精密称取适量，按“3．2”项下供试品溶液配制方法配成阴性对照品溶液。
4 方法和结果
4．1 色谱行为 在上述色谱条件下，色谱图见图1。�
4．2 标准曲线制备 精密吸取10 mg/ml的华法林对照品储备溶液1 ml置50 ml容量瓶，加水稀释至刻度，充分摇匀，得200 μg/ml的溶液，取上述溶液2 ml置50 ml容量瓶，加水稀释至刻度，充分摇匀，得8 μg/ml的溶液，再分别取此溶液1、2、3、4、5、6、7 ml置10 ml容量瓶，加水稀释至刻度，充分摇匀，得0．8、1．6、2．4、3．2、4．0、4．8、5．6 μg/ml的标准溶液。按色谱条件进行测定。以华法林标准溶液的浓度(C)对其峰面积A进行线性回归，得回归方程为：A=37 319．69C+228．58(r＝0．999 6)。结果表明，华法林在0．8~5．6 μg/ml浓度范围内，华法林的峰面积与其浓度呈良好的线性关系。
4．3 回收率及精密度试验 精密称取已知含量的华法林供试品粉末适量(约相当于华法林2．5 mg)，置于50 ml容量瓶中，分别精密加入华法林对照品储备溶液225、2．50、275 μl(相当于华法林2．22、2．46、2．71 mg，即对照品含量的90%、100%、110%)，按供试品溶液制备方法进行操作，按上述色谱条件测定并以实测值除以华法林对照品加入量，计算加样回收率。结果见表1。平均加样回收率为100．64%(n＝15),RSD为1．11%。�
表1
4．4 重复性试验 取同一批号样品5份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取20 μl，每份进样1次，对主要色谱峰的峰面积进行考察，峰面积的RSD为0．53%(n=5)。
4．5 稳定性试验 精密吸取新配制的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h各进样20 μl，记录色谱图，测定华法林峰面积值，RSD为0．93%，可见供试品溶液在8 h内稳定，峰面积无明显变化。
4．6 阴性试验 精密吸取“3．3”项下配好的阴性对照品溶液20 μl，按色谱条件进行测定。结果华法林对照品的出峰时间处不出现色谱峰，可见辅料对主药测定无干扰。
4．7 样品测定 精密称取适量样品，按“3．2”项下供试品溶液配制方法配成样品溶液，按色谱条件进行测定,样品的含量测定结果见表2。A、B、C 三个样品的含量分别为95．18%、95．17%和97．24%。�
5 讨论�
因受辅料影响，对样品进行前处理时，样品在水中溶解不完全，故加入适量0．1 mol/L的氢氧化钠溶液使溶解完全。在本法流动相：乙腈-水-冰醋酸(70∶30∶1)下进行测定，华法林的分离效果好，标准品以及A、B、C三个样品都得到很好的分离,无杂峰干扰。由图1可见，阴性对照试验下华法林对照品的出峰时间处不出现色谱峰，可见辅料对主药测定无干扰。用该HPLC法测定A、B、C三个样品，其含量分别为95．18%、95．17%和97．24%，均在含量限度(93%~107%)内，其含量合格。�
中国药典2005版采用紫外分光光度法测定华法林片的含量，方法繁琐，操作复杂，而本法简便，快捷，结果准确，重现性好，可作为华法林片质量控制的有效方法。�
参考文献
［1］ 陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学.人民卫生出版社，2003：527-528.
［2］ USP.Sterile water for injection.U.S.Pharmacopeia convention Inc.,Rand Macnally,Taunton,Mass.PP,1995,23:1635-1636.
