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【摘要】 目的 初步探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)及其变异体(PSMA5)DNA检测在前列腺癌诊断中的临床意义。方法 用自建的荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测方法检测前列腺增生及前列腺癌患者及正常对照组外周血单个核细胞和血浆中PSMA和PSMA5 DNA的含量。结果 在前列腺癌及前列腺增生患者外周血单个核细胞中PSMA DNA含量及水平明显高于正常对照组。而PSMA5 DNA含量在前列腺癌患者的外周血单个核细胞中明显高于PSMA DNA。结论 PSMA及PSMA5 DNA在外周血单个核细胞中的差异提示了作为前列腺癌的肿瘤标志物,PSMA5更具有肿瘤特异性,对其DNA的检测为前列腺肿瘤标志物的研究指明了一条新的道路。
【关键词】逆转录聚合酶链反应; PSMA; 前列腺肿瘤;临床应用
Establishment of real time quantitative PCR to test PSMA and alternative spliced variant PSMA5 and exploration the application in the clinical
YAN Hai-yan,XIE Wen-feng,ZENG Hua,et al.Clinical Laboratory,Standard Research Center for Clinical Laboratory,the Sun-Yat sen Memory Hospital of Sun-Yat sen University,Guang-zhou 510080,China
【Abstract】 Objective Explore the clinical application of PSMA and PSMA5 in the diagnosis of the prostatic carcinoma and prostate hyperplasia.Methods Using the quantitative RT-PCR method built by ourselves to test the PSMA DNA in LNcap cells andthe peripheral blood cell of the prostate hyperplasia and prostate tumor patients.Results PSMA DNA in the peripheral blood cells of the prostate hyperplasia and prostate cancer patients were more than those of the normal ones.PSMA5 DNA in the peripheral blood cells of the prostate cancer patients were more than PSMA mRNA.Conclusion The difference of PSMA and PSMA5 DNAin the peripheral blood cells showed that PSMA5 is more specific as a prostate tumor maker.Give us a new research wayto use the PSMA as a prostate tumor marker.
【Key words】RT-PCR; PSMA; Prostate tumor;Application in clinical
前列腺特异性膜抗原PSMA是前列腺腺上皮细胞膜上的一种2型跨膜蛋白[1]。近年来对PSMA的研究发现其作为前列腺癌的生物标志物比PSA更具有组织特异性,已成为前列腺癌研究领域的热点。而其变异体的发现为前列腺癌的研究又提供了新的研究方向和思路,PSMA5是本课题组发现的PSMA的变异体[2]并建立了一种能区分PSMA和PSMA5DNA的实时荧光定量PCR分析方法。为了解和研究PSMA和PSMA5DNA检测的临床应用价值,我们通过该法对在前列腺增生及前列腺癌患者的外周血中的PSMA及PSMA5DAN进行定量分析和研究,对其在前列腺癌及增生疾病的诊疗中的应用作一初步探索。
1 资料和方法
1.1 一般资料 经证实表达PSAM的前列腺癌LNCap细胞株(为本课题组保存)。10例正常前列腺组织标本取自健康人被剥夺生命者。
1.1.1 标本的采集与保存 10例正常外周血标本取自健康体检者,均为男性,年龄范围23~55岁,平均(34±12)岁。血液标本采用内有20~30 u/ml浓度的肝素抗凝的一次性真空抽血管,抽取患者空腹全血3 ml,于3 h内分离单个核细胞,采用常规的单个核细胞分离方法,置于无RNase的EP管内,然后放-80℃冰箱保存。 同时离心分离血浆标本,也是置于无RNase的EP管内,然后放-80℃冰箱保存。
前列腺癌病例一共8例,年龄范围56~76岁,62±8岁 ;前列腺增生病例共3例,年龄范围66~72岁。
1.1.2 主要试剂与仪器 RT-PCR 试剂盒(invitrogen 公司),PC3.0-T 质粒(TaKaRa 公司),Trizol(Sangon 公司),Opticon2 荧光定量PCR 仪(美国MJ 公司),SYBERGREEN荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)。2kb DNA Marker(鼎国生物公司)。
1.2 方法
1.2.1 引物设计和反应体系 按照Israeli等发表的人PSMA的cDNA全序列(Genbank登录号M99487)和我室新发现的PSMA变异体PSMA5(提交序列号:PSM-E,Genbank登录号EF488811)的序列,用Primer Premier 5.0软件设计引物。PT上游引物5"-TACCACATTTAGCAGGAACAGAAC-3",下游引物5"-AACCATCTGGATAGGACTTCACC-3",拟扩增片段长度498bp,PCR参数为:95.0℃2 min→(94.0℃ 30 s,60.0℃ 30 s,72.0℃40 s)×41→72.0℃2 min→4℃保温;P上游引物5"-GAGCTCGGATCCGAGATGTG-3",下游引物5"-ATTTTATAAACCACCCGAAG-3",拟扩增片段长度146bp,PCR参数为:95.0℃ 2 min→(94.0℃ 30 s,58.0℃ 30 s,72.0℃40 s)×41→72.0℃2 min→4℃保温;P5上游引物5"-GCCAACTGCAAGGTCTAATG-3",下游引物5"-CCTGCTAAATGTGGTATCTGTG-3",拟扩增片段长度225bp;PCR参数为:95.0℃ 2 min→(94.0℃ 30 s,54.0℃ 30 s,72.0℃ 40 s)× 41→72.0℃ 2 min→4℃保温,G上游引物5"-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3",下游引物5"-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3",拟扩增片段长度223bp,PCR参数:95.0℃2 min→(94.0℃30 s,60.0℃ 30 s,72.0℃40 s)× 41→72.0℃2 min→4℃保温。所有引物均由Invitrogen公司合成。
1.2.2 构建PC3.0-T-PSMAcDNA 质粒和PC3.0-T-PSMA5cDNA质粒作为标准品:碱裂解法提取质粒pcDNA3.0,用BamHI和XhoI双酶切质粒和PCR产物,各自回收纯化后用T4连接酶连接。将PC3.0-T-PSMAcDNA质粒和PC3.0-T-PSMA5cDNA质粒用10倍梯度稀释法得到系列浓度的标准品。
1.2.3 反应体系 cDNA 1 μl,H�2O 8 μl,Forward primer(50μM)0.2 μl,Reverse primer(50μM)0.2 μl,MASTER MIX(2X)10 μl,总的反应体系共20 μl。其中试剂盒配套MASTER MIX(2X)是各种试剂的混合液,其中包括RNase Free dH�2O、Buffer、各种酶等。
1.2.4 样品检测 每次检测均加入一空白管作一阴性对照,每个样品通过PCR 反应得到各自的Ct 值,样品测得Ct 值后,仪器自动绘出标准曲线并给出初始拷贝数。
2 结果
P�T、P及P�53对引物在外周血细胞和血浆中对PSMA总、PSMA和PSMA5 DNA的定量扩增结果,见下表。
表1
P�T、P及P5在外周血细胞和血浆中对PSMA总、PSMA和PSMA5 DNA的定量扩增结果(×10�6copies/μg)
PSMA总DNAPSMA DNAPSMA5 DNA
血细胞血浆血细胞血浆血细胞血浆
前列腺癌1.32±0.5602.15±1.3302993.65±2112.10
前列腺增生0.279±0.22010.9±3.45000
正常对照0.3±0.1200.3±0.1800.1±0.090
3 讨论
实验过程中我们用P�T、P及P�5这三对引物分别对前列腺癌LNCap细胞进行RT-PCR试验。三种引物各自的扩增产物长度经电泳证明,分别与设计引物时所预测的长度相吻合;内参GAPDH也能很好的从LNCap细胞上扩增出来,而阴性对照蒸馏水经定量PCR是没有扩增产物的[3]。该结果表明该方法符合我们设计初衷。
已往的研究认为PSMA是前列腺癌较好的肿瘤相关抗原,它在正常、增生、原发性前列腺癌及其转移灶中以及肿瘤新生血管中均有表达,且高水平的PSMA表达与肿瘤的侵袭力有关[4]。我们在研究中发现PSMA与PSMA5在正常前列腺组织中的平均表达量为0.94×10�3copies/μl和0.4×10�3copies/μl。在增生前列腺组织中PSMA和PSMA5的平均表达量为2.22×10�3copies/μl和10.87×10�3copies/μl。PSMA5 DNA在多个病例组织中被检测到,证实了该变异体的存在不是个别的基因突变现象,而是一个广泛存在的基因调控的可变剪接结果[5]。此外,正常组织与病变前列腺组织中PSMA5 DNA的检测结果具有明显差异,与PSMA不同,后者在所有前列腺上皮组织中均有检测。提示PSMA5具有更高的前列腺病变组织特异性,与前列腺组织的病变密切相关。在临床上具有辅助诊断的应用价值,有望成为前列腺癌生物治疗的靶点。本研究首次将PSMA5的定量分析引入前列腺癌的诊断研究,发现其有着优于PSMA的组织特异性和病变特异性,但两者作为前列腺癌的生物学标志物,如能将其综合互补应用在临床诊断前列腺癌,相信将大大提高前列腺癌的检出率及正确率。同时,此方法相对于病理学诊断具有无创、快速、简便、易标化等优点,更适于在定量水平对患者进行动态的观察,对术后随访及疗效评价都是一个有益的探索。
参考文献
[1] Cao KY,Mao XP,Wang DH,et al.High expression of PSM-E correlated with tumor grade in prostate cancer:a new alternatively spliced variant of prostate-specific membrane antigen.Prostate,2007,67(16):1791-1800.
[2] 曹开源,戴淑琴,肖娜,等.新型前列腺特异膜抗原剪接变异体的发现及临床意义探讨.中国病理生理杂志,2006,22(11):2185-2188.
[3] Neves AF,Araújo TG,Biase WK,et al.Combined analysis of multiple mRNA markers by RT-PCR assay for prostate cancer diagnosis.Clin Biochem,2008,41(14-15):1191-1198.
[4] Tang QL,Yao MY.Updated application of prostate-specific membrane antigen to the diagnosis and treatment of prostate cancer.Zhonghua Nan Ke Xue,2008,14(1):79-82.
[5] Antunes AA,Leite KR,Sousa-Canavez JM,et al.The role of prostate specific membrane antigen and pepsinogen C tissue expression as an adjunctive method to prostate cancer diagnosis.J Urol,2009,181(2):594-600.
