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【摘要】 目的利用色谱和光谱方法研究兴化莳萝地上部分的化学成分。方法 通过乙醇-水梯度提取,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,硅胶、凝胶、反相柱层析和薄层色谱等技术分离出纯化合物,通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱等光谱技术分析化合物结构。结果 从石油醚及乙酸乙酯部位分离鉴定出四个化合物,分别为3-羟基-9(11),12-齐墩果烯(I)、邻苯二甲酸二异辛酯(II)、β-谷甾醇(III)及其苷β-胡萝卜苷(IV)。结论 明确了兴化莳萝地上部分的化学成分,为其进一步研究开发利用提供实验依据。
【关键词】 毒芹属;宽叶毒芹;化学成分;13C-NMR, 1H-NMR
The Chemistry Research Of Cicuta virosa L.var.latisecta Celak
GAO Shan,XU Kang-kang.Nanjing Children’s Hospital,210008 China
【Abstract】 Objective To study the constituents of the herb ofCicuta virosa L.var.latisecta Celak through chromatography and spectra methords.Methods We apply ethanol with different proportion of water to extract the compositions of the herb to get the water solution, then extract the water solution by petroleum, ethyl acetate and n-butanol.The spectrum methods of 1H-nuclear magnetic resonance spectrometry, 13C-nuclear magnetic resonance spectrometry and mass spectrometry are used to determine the structure of these compositions.Results We obtain four compositions from the petroleum fraction and ethyl acetate fraction, they are 3-hydroxyl -△9(11),12-olean-en(I), dioctyl phthalate(II),-sitosterol (III), dancosterol(IV).Conclusion We determined the chemical components of the herb of Cicuta virosa L.var.latisecta Celak.The research results provide experimental evidence for the further exploration.
【Key words】 Cicuta L;Cicuta virosa L.var.latisecta Celak;Chemical composition;13C-nuclear magnetic resonance spectrometry;1H-nuclear magnetic resonance spectrometry
作者单位:210008南京市儿童医院/南京医科大学附属南京儿童医院
1 概况和研究进展
1.1 植物概况
莳萝属(Anethum L.)是伞形科植物的一个属,该属为单种属,原产欧洲南部,今世界各地广泛栽培,我国南北各地亦有栽培,。毒芹是同科毒芹属植物。毒芹属(Cicuta L.) 约20种,分布在被温带地区,我国有1种及变种。莳萝属的应用范围较为广泛,但江苏地区则多用毒芹属。目前,国内外学者对莳萝的化学成分、营养剂药理活性做过比较深入的研究,有关该植物的栽培技术及无机元素分析的报道也很多。国内外学者对毒芹的研究主要集中在其毒性方面,有文章对其毒性的物质基础和作用机理作过详细的报道,对其他化学成分和药理活性方面也有报道。本文主要对莳萝属的莳萝,毒芹属的毒芹进行化学成分和生物活性方面的综述,为其进一步的开发研究利用和其他同科相关职务的研究提供参考。
1.2 莳萝属植物的概况 莳萝属为单种属,该属全世界仅有莳萝一种植物分布,原产于欧洲南部,今全世界各地都有引种栽培,我国东北、甘肃、四川、广东、广西等地有栽培[1]。
一年生草本,稀为二年生,高60～120 cm,全株无毛,有强烈香味。茎单一,直立,圆柱形,分枝,光滑。基生叶轮廓卵圆形或宽卵形,有叶柄,长5～6 cm。叶基有宽阔叶鞘,长约1.5～3 cm,宽约1～1.5 cm,边缘膜质,白色;叶片轮廓宽卵形,2～4回羽状全裂,末回裂片丝状,长4～20 cm,宽不及0.5 mm。茎上部叶较小,分裂次数少,仅有叶,鞘无叶柄。复伞形花序多分枝,无总苞和小总苞;伞形花序直径5～15 cm;伞辐10~25,稍不等长,小伞形花序有花15~25;花柄长5～6 mm;花瓣黄色,内曲,早落;无萼齿;花柱短,初时直立,果期向下弯曲,花柱基圆锥状或垫状。分生果卵状椭圆形,顶端略尖,背部扁压状,灰褐色,背棱线形,稍突起,侧棱呈狭翅状,浅灰色,长3～4 mm,宽2～2.5 mm;每棱槽中油管1,合生面油管2;胚乳腹面平直;分生果易分离和脱落。花果期5~9月。全株有茴香味,尤以果实较浓,嫩茎叶供做蔬菜食用,果实可提取芳香油,是调和香精的原料,果实可入药,有驱风、健胃、散瘀、催乳等作用。临床上多用来治疗腹中冷痛,胁肋胀痛、呕吐食少等症[2]。
1.3 毒芹属植物的概况 毒芹属Cicuta L. 约20种,分布在被温带地区,主产于北美,我国有1种及1变种[1]。产于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、陕西、甘肃、四川、新疆等省区,生于杂木林下,湿地或水沟边。除我国外在俄罗斯远东地区,蒙古,朝鲜,日本也有分布[3]。
毒芹(原变种)为多年生粗壮草本,高70～100 cm。根粗壮或有须根,主根短缩,支根多数,根茎部有横膈膜髓,茎粗大,中空。叶有柄,基部有鞘,宽展,叶为2～4回羽状复叶,复伞形花序顶生或腋生,总苞片少数或缺,小总苞片多数,较小,花瓣白色,倒卵形或近圆形。顶端有内弯的狭裂片;花柱基扁平;花柱基细长或短。果实圆形,两侧扁,在合生面稍变狭;分生果近卵圆形,横剖面钝五角形,5主棱较厚,钝圆,每棱槽中有油管1条,合生面有2条。花期10~11月[1]。含有毒物质毒芹碱(Cicutin)和毒芹素(Cicutoxin),牲畜误食会引起中毒。
宽叶毒芹是分布于吉林和江苏兴化地区的毒芹属植物的变种。另外在俄罗斯萨哈林岛,日本也有分布。关于宽叶毒芹的报道较少。如今仅发现有鲁安中等对宽叶毒芹果实脂肪酸的研究及宽叶毒芹的生药学研究等零星报道。
1.4 本草资源考查
莳萝Anethum graveolens L.为伞形科植物。原产于欧洲南部[1],我国有一属一种,全株无毛,有强烈香味,茎单一,直立,圆柱形。叶基有宽阔叶鞘,边缘膜质;叶片轮廓宽卵形,3-4回羽状全裂,末回裂片丝状,宽不及0.5 mm。茎上部叶较小,仅有叶鞘无叶柄。复伞形花序,无总苞片;花瓣黄色。分生果卵状椭圆形,成熟时褐色。同科毒芹属植物在我国仅有一种及一个变种。原种毒芹Cicuta virosa L. 为有毒植物,我国南北均有分布,本种在东北地区又称“走马芹”,有误食中毒的记载,变种宽叶毒芹Cicuta virosa L.var.latisecta Celak为多年生草本,叶互生,三回羽状全裂 或三出式二回羽状分裂,最后裂片大,长椭圆形或长椭圆状卵形,边缘有细锯齿。上部茎生叶1-2回羽状分裂,复伞形花序,花瓣白色,果实卵圆形,如圆形“宫灯”状,长宽约2 mm。宽叶毒芹的果实,至今在山东,江苏,浙江等地作莳萝子使用[2]。
由于历史原因,在江苏,山东等地部分地区一直将毒芹属植物的变种宽叶毒芹作莳萝使用,何金鹭,陈家骅等曾对此作了详细的本草考证。经查,莳萝长期混作小茴香使用,而历代本草所载莳萝为马芹。马芹一名自清代后匿而不现,考证后得出马芹及今伞形科毒芹属植物。莳萝始载于《开宝本草》。《图经本草》中这样描述“今岭南及近道皆有之,三四月生苗,花实大类蛇床而簇生,辛香,六七月采实。”《本草纲目》“其子簇生,状如蛇床而短,微黑,气辛臭,不及茴香。”均可说明所载植物为伞形科植物。
马蕲,《本草纲目》收于菜部第二十六卷,曰,“马蕲与芹同类而异种,处处卑湿地有之。三、四月生苗,一本丛出如蒿,白毛蒙茸,嫩时可茹。叶似水芹而微小,似芎穷叶而色深。五、六月开碎花,攒簇如蛇床子及莳罗花,青白色。结实亦似莳罗子,但色黑而重尔。其根白色,长者尺许,气亦香而坚硬,不可食。子,甘辛温无毒,治心腹胀满,开胃下行消食,调味用之”。此以前,宋《证类本草》载有马芹子一药,唐慎微曰:“马芹子,唐本注云:生水泽傍,苗似鬼针、恭菜等,花青白色,子黄黑色,似防风子。臣禹锡等瑾按蜀本图经云:花若芹花,子如防风子而偏大。尔雅云:茭,一名牛蕲,一名马蕲。子入药用。孟铣云:和酱食,诸味良。根及叶不堪食。卒心痛,子作末,醋服。日华子云:马芹,嫩时可食。子治卒心痛,炒食令人得睡。马芹子,味甘、辛、温,无毒。主心腹胀满,下气,消食。调味用之。香似橘皮,而无苦味。”比较两本本草所载的马蕲和马芹子,其形态描述、性味、功用完全吻合,加之古代“蕲”音“芹”,因此,笔者认为马蕲就是马芹。那么马蕲今何植物呢?据《兴化市中药资源普查资料》载:主产于江苏兴化的宽裂叶毒芹,其生物学特征,三月上旬出苗,中旬齐苗,下旬抽苔,五月开花,花白色,六月结实,七月完成生殖生长,根粗壮白色。其赶在成熟果实作药用。味辛,性温,有益脾胃,去冷气,开胃,增加食欲等功效。与马蕲在形态、性味、功效上比较相符。如此,似可确定《本草纲目》中马蕲应为伞形科植物宽裂叶毒芹。
毒芹(通用名);走马芹(新民铁岭);河毒(本溪);芹叶钩吻(余匾要略)生于河边,水沟旁,沼泽,湿草甸子,林下水湿地。产于辽宁铁岭、开原、西丰、本溪、新民、彰武等县及沈阳市;吉林省安图县、抚松县、清宇县、敦化县、浑江县、科尔沁右翼前旗、科尔沁左翼后旗、扎鲁特旗;黑龙江省阿城县、爱辉县、伊春市、哈尔滨市、额尔古纳右旗、鄂伦春自治旗、新巴尔虎左旗、满洲里市。分布于中国(东北、华北、西北、内蒙),朝鲜、日本、蒙古、苏联及其他欧洲国家。用途:全草可供药用。苏联民间利用植株地上部分制成软膏和浸剂制;治疗慢性发诊病。新鲜的根茎的制剂用作治疗癫痫、破伤风及产褥期痉挛的同种疗法药。全草有剧毒。根茎具香气,带有甜味,内切口处流出的淡黄色树脂状液体遇空气后立即变暗色,这是引起严重中毒的物质。中毒后毒性发作极快(45 min～1 h)死亡率为50%。有毒物质是Cicutin和Cicutoxin。鲜草和干草均有毒,往往由于毒芹干草混入饲料引起家畜中毒。据记载,毒芹干草400 g即可毒死马。果实中含有挥发油,油中主要成分为枯茗醛和伞花烃。干燥果实中含挥发油0.12%～0.36%,油中含萜烯。茎叶主含挥发油[4]。
莳萝长期混作小茴香,而历代本草所记载的莳萝则是马芹。马芹一名自清代便匿而不见,经考证,马芹即今伞形科毒芹属的植物。
1.5 化学成分的研究
伞形科植物莳萝(Aenthum graveolens L.)果实用于治疗消化道疾患,刺激母乳分泌,缓慢婴幼儿呃逆和疝痛。根据报道果实中含有精油(3%-4%)。研究了莳萝子的水溶性成份,并探讨精油和水溶性成份之间的关系。从莳萝子甲醇提取物的水溶性组分中分离出33个成分,其中有一个新的单萜、6个新的单萜苷,1个新的芳香化合物葡萄苷和1个新的烃基葡萄苷。市售莳萝果实(20 kg)用70%甲醇提取,甲醇提取物混悬于水,依次用乙醚和乙酸乙酯提取,分别得到溶于乙醚、乙酸乙酯和水的部分。将溶于水的部分上Amberlite XAD-Ⅱ柱层析,得到水洗脱部分和甲醇洗脱部分。这2部分分别上葡聚糖凝胶LH-20柱、硅胶柱、LobarRP-8柱层析,经HPLC纯化。从甲醇洗脱部分中得到2个单萜酮二醇(1、2)、8个单萜苷(3-10)、7个芳香化合物苷(11-17);从水洗脱部分得到3个烃基苷(18-20)、11个糖簇族化合物(21-31)和2个核苷(32、33)。其中,2-4、6-8、10、11、和18为新部分。所有分离出的新葡萄糖苷均为β-D-吡喃葡萄苷[5]。
甘肃省新医药学研究所金育忠、石长拴、王玉洁、徐海滨采用GC-MS联用仪对产自甘肃省河西地区的莳萝籽挥发又进行了分离、分析研究从中鉴定出16个成分,其中用GC-MS对已鉴定了的化合物名称和按组分峰面积归一化计算出它们的相对含量。结果如下:乙酸乙酯3.13%,2-2氧基丁烷0.42%,1-2氧基丁烷0.21%,α-蒎烯1.89%,水芹烯5.32%,柠檬烯12.64%,2-甲基-3-苯基丙烯0.41%,1-甲基-4(1-甲基)乙烯基环己烷骈氧环(4,1,0)0.63%,二氢香芹酮6.57%,α-香芹酮40.37%,3-甲基-6-(异丙烯基)-1-酮基环乙1.85%,4-丙烯基-1-甲氧基苯0.82%,4-甲氧基-6-异丙烯基-苯骈二恶茂0.23%,5-异丙烯基-1,2,3-三甲氧苯0.14%,4,7-二甲氧基-5-异丙烯基苯骈(1,2)二恶茂8.26%,邻苯二甲酸双-2甲氧基乙酸0.42%[6]。
兴化市药品检验所的鲁安中采用气相色谱技术,分离鉴别兴化莳萝果实脂肪油中9种脂肪酸(酯),其中月桂酸寒0.72%,肉豆蔻酸20.60%,软脂酸(酯)含24.42%,十六碳烯酸(酯)含0.94%,硬脂酸(酯)含1.09%,油酸(酯)含7.58%,亚油酸(酯)含34.76%,亚麻酸(酯)含8.70%,其中未鉴定酸(酯)含1.14%,以亚油酸(酯)含量最高[7]。
天津医科大学的王鸿梅、冯静采用GC-S法鉴定了毒芹根挥发油中的39个化学成分,并分别测定其含量。从毒芹根挥发油中鉴定出39个成分,其中对-聚伞花素占总量的比例数为8.93%,以下依次为,毒芹素(7.56%)、L-柠檬烯(5.51%)、γ-松油烯(5.14%)、L-α蒎烯(3.06%)。在已鉴定的成分中,脂族化合物15种,占已鉴定总数的57.34%;萜类化合物15种,占已鉴定总数的38.90%;芳香族化合物3种,占已鉴定总数的3.77%。在已鉴定出的39个成份中,以脂族化合物为主,萜类化合物次之,但含量也高达38.90%。萜类化合物具有止血、消肿、抗炎、健胃、清热解毒、降低血压、止痛调经等疗效。同时,毒芹乃剧毒物质,其毒性成分为毒芹素,主要含于根部。检出毒芹素占毒芹根已检出部分含量为7.56%。在民间毒芹只要用于外用,治疗某些皮肤病、痛风、风湿等,适量的毒芹还可用于治疗骨髓炎。毒芹果实中挥发油主要成分为对-聚伞花素、γ-松油烯、β蒎烯,其他如柠檬烯、松油烯含量很少,而他们从毒芹根挥发油中鉴定出来的主要化合物为对-聚伞花素、毒芹素、L-柠檬烯、γ-松油烯、L-α蒎烯[8]。
2 兴化莳萝化学成分研究
2.1 仪器、试剂和材料 药材:经本研究室钱士辉研究员鉴定为伞形科植物莳萝,试剂材料:石油醚由北京长海化工厂生产,乙酸乙酯、甲醇由天津市化学试剂批发有限公司生产,无水乙醇由上海久亿化学试剂有限公司生产,三氯甲烷、丙酮、正丁醇由天津市博迪化工有限公司生产,柱层析及薄层硅胶为青岛海洋化工厂生产,薄层层析硅胶板由烟台江友硅胶开发有限公司生产。熔点测定用XT4A型显微熔点仪,IR测定用FTIR8900型红外光谱仪(KBr压片),NMR测定用Bruker AV500 和AV300核磁共振仪,ESI-MS测定用Micromass Q-TOF micro 质谱仪和Agilent 1100 series LC/MS Trap质谱仪,HR-ESI-MS测定用APEX质谱仪。
柱层析聚酰胺及薄层层析聚酰胺薄膜为浙江台州路桥四甲生化塑料厂生产,大孔树脂D101由天津化学试剂二厂生产,ODS填料由江苏汉邦生产,Sephadex LH-20 填料由Pharmacia Biotech公司生产。
2.2 提取分离 将采集回的药材净制晒干,工业乙醇梯度提取获得总浸膏,用水分散后再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取得各部位浸膏。将石油醚部位与乙酸乙酯部位合并,100-200目硅胶拌样,200-300目硅胶装柱,石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱,得到十八个部分(frc.1-18)。再进一步用硅胶,凝胶和反相材料进行柱层析,先后从该frc.8、frc.13和frc.17三个部分分离得到四个化合物,经过谱图数据分析及文献数据对照确定这四个化合物分别为9(11),12-齐墩果烯(I)、邻苯二甲酸二异辛酯(II)、β-谷甾醇(III)及其苷β-胡萝卜苷(IV)。分离流程图见图1。
图1 分离流程图
2.3 结构鉴定
2.3.1 化合物I的结构鉴定 CNMR(150MHz,CDCl3):38.7(C-1); 27.9(C-2); 78.7(C-3); 38.9(C-4); 51.1(C-5); 18.3(C-6);32.1(C-7);37(C-8);154.3(C-9);40.6(C-10);115.7(C-11);120.7(C-12);147.1(C-13);42.7(C-14);25.6(C-15);27.2(C-16);32.1(C-17);45.6(C-18);46.9(C-19);31.1(C-20);34.6(C-21);37.1(C-22);28.2(C-23);15.6(C-24);20(C-25);20.9(C-26);25.2(C-27);28.2(C-28);23.7(C-29);33.1(C-30),与文献数据对照基本一致,因此可以判定为同一化合物[9]
图2 化合物I的结构
2.3.2 化合物II的结构鉴定 CNMR(150MHz,CDCl3):132.5(C-C1);132.5(C-2);128.8(C-3);130.8(C-4);130.8(C-5); 128.8(C-6);167.6(C-7);167.6(C-8);68.1(C-9);(C-10);(C-11);(C-12);(C-13);38.8(C-14);13.9(C-15);10.9(C-16);68.1(C-17);(C-18);(C-19);(C-20);(C-21);38.8(C-22);13.9(C-23);10.9(C-24),与文献数据对照基本一致,因此可以判定为同一化合物[10-11]。
图3 化合物II的结构
2.3.2 化合物III的结构鉴定 CNMR(150MHz,CDCl3):37.2(C-1);28.2(C-2);71.8(C-3);37.2(C-4);140.7(C-5); 121.7(C-6);31.9(C-7);31.6(C-8);50.1(C-9);36.5(C-10);21(C-11);39.7(C-12);42.3(C-13);56.7(C-14);24.3(C-15);28.1(C-16);56(C-17);11.8(C-18);19.3(C-19);36.1(C-20);18.7(C-21);33.9(C-22);26.1(C-23);45.8(C-24);29.2(C-25);19.8(C-26);18.9(C-27);23(C-28);11.9(C-29),与文献数据对照基本一致,因此可以判定为同一化合物[12]。
图4 化合物III的结构
2.3.2 化合物IV的结构鉴定
化合物IV通过与本实验室标准品TLC分析对照,结果显示为同一化合物。
图5 化合物IV的结构
参 考 文 献
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.五十五卷.第二分册,1979:213.
[2] 江苏植物志.
[3] 中国高等植物图鉴.第二册.中国科学院植物研究所,1972:1069.
[4] 东北草本植物志.第六卷.辽宁省林业土壤研究所.科学出版社,1977:201-203.
[5] Toru ISHIK AWA,Masato KUDO, Junichi KITAJIKA.Water-Soluble Constituents of Dill.Chem Pharm Bull,2002,50(4):501-507.
[6] 金育忠,石长拴,王玉洁,等.莳萝子挥发油成分的研究.中草药,1996,27(11):654.
[7] 鲁安中.兴化莳萝果实油脂中脂肪酸的鉴定.江苏药学与临床研究,1999,7(4):45-46.
[8] 王鸿梅,冯静.毒芹根挥发油中化学成分的研究.天津医科大学学报,2000,6(4):376-377.
[9] Shashi B,Mahato and Asish P,Kundu.13CNMR Spectra of Pentacyclic Tritererpenoids-A Compilation and Some SalientFeatures.phytochemistry,1994,37(6):1517-1575.
[10] Essential chemical constituents from branches of Daphne genkwa.Liu, Zi-wu; Chen, Cai-fa; Du, Bai-xiang; Wang, Xue-mei.Xuzhou Shifan Daxue Xuebao, Ziran Kexueban,2005, 23(1):60-63.
[11] 于德泉,杨峻山.分析化学手册.第七分册核磁共振波谱分析.化学工业出版社,1999:594.
[12]Adolfo M.Iribarren, Alicia B.Pomilio.Phytochemistry,1984,23(9):2087-2088.
