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[摘要] 目的:建立高效液相色谱法(HPLC)测定何首乌中二苯乙烯苷含量的方法。方法:采用高效液相色谱法(HPLC),以十八烷基硅烷键合相硅胶为固定相(4.6 mm ×250 mm,5 μm),色谱纯乙腈-水(25∶75),检测波长325 nm,流速为1.0 ml/min,色谱柱柱温30 ℃,测定何首乌中主要成分二苯乙烯苷的含量。结果:何首乌中二苯乙烯苷进样量在0.200～4.000 μg 范围内,与峰面积呈良好的线性关系,其回归方程为Y=152.92X+45.67(r=0.9997);平均回收率为99.96%。结论:该方法操作简单、方便、准确、重复性好,用于测量二苯乙烯苷的含量可信度高。
[关键词] 何首乌;二苯乙烯苷;高效液相色谱法;含量测定
[中图分类号] R283 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2010)06(c)-041-02
HPLC Determination of stilbene glucoside in polygonum multiflorum content
determination of content of 2, 3, 5, 4"-tetrahydroxystilbene-O-β-D-glucoside in radix polygoni multiflori
SU Lijie
(Chinese Medicine Hospital of Xiangtan City, Hunan Province, Xiangtan 411100, China)
[Abstract] Objective: To establish a method for the determination of 2, 3, 5, 4"-tetrahydroxystilbene-O-β-D-glucoside in radix polygoni multifloriby HPLC. Methods: The condition of HPLC was KromasiL C18 column (octadecylsilan reversed bonded phase, 4.6 mm×250 mm, 5 μm), mobile phase of chromatographic purity acetonitrile:water (25:75) and UV dector at 325 nm. The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was 30℃. Results: The method proved to be linear in the range at 0.200-4.000 μg with correlation coefficient of 0.999 7. The linear formula was Y=152.92X+45.67. The average recovery and recision were 99.96%. Conclusion: The method is simpLe, accurate, and can be a effective method to control the quality.
[Key words] Radix polygoni multiflori ; 2, 3, 5, 4"-tetrahydroxystilbene-O-β-D-glucoside; HPLC; Assessment
何首乌为蓼科植物何首乌(polygonum multiflorum thunb)的干燥块根,具有补肝肾、益精血、乌须发、壮筋骨、解毒、消痛、润肠通便之功效[1]。何首乌中二苯乙烯苷类成分在抗衰老、抗老年痴呆、增强机体免疫、造血和改善心血管功能等方面有许多独到之处[2]。本文采用高效液相色谱法,对二苯乙烯苷类的含量测定进行了方法学方面的考察试验。该方法操作简单、方便、重复性好,用于测定含量可信度高,效果满意。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Waters高效液相色谱仪;Empower 色谱工作站;KromasiL C18 反相柱( 4.6 mm ×250 mm,5 μm);纯水器。
1.2 试剂
纯水,溶剂均为分析纯;流动相为色谱纯,2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品,简称二苯乙烯苷,购于中国药品生物制品检定所。
1.3 试验材料
何首乌药材干粉碎过60目筛,于60°C干燥至恒重后置干燥器中备用。
1.4 高效液相色谱条件
色谱柱:KromasiL C18反相柱;流动相色谱纯乙腈-水(25∶75),流速1.0 ml/min:色谱柱柱温30 ℃;紫外检测波长325 nm,理论板数按二苯乙烯苷计算应不低于2 000[3],与其他组分均能达到较好的分离。进样体积:10 μl。此条件下,二苯乙烯苷的保留时间为6.857 min(图1)。
1.5 溶液的制备
1.5.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的二苯乙烯苷对照品10.00 mg置50 ml棕色容量瓶中,加色谱纯甲醇溶解,定容至刻度,摇匀,制成每1毫升含0.2 mg 的溶液,即得浓度为200 μg/ml的二苯乙烯苷对照品溶液,冰箱内保存,备用。
1.5.2 供试品溶液的制备称取何首乌细粉0.250 g,精密称定,置50 ml棕色具塞三角瓶中,加水2 ml使之溶解,准确加入色谱纯甲醇20 ml,超声处理30 min(功率:120 W,超声频率:40 kHz),取出,放冷,滤过,弃去初滤液,减压挥干溶剂,残渣加甲醇超声溶解,定容至50 ml容量瓶,摇匀并将滤液过0.45 μm微孔滤膜,即得供试品溶液。
2 实验方法和结果
2.1 线性关系考察
精密称取二苯乙烯苷对照品溶液1.0,4.0,8.0,10.0,12.0, 16.0,18.0,20.0 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别吸取以上稀释溶液各10 μl,注入液相色谱仪,记录相应的峰面积积分值,以峰面积的自然对数为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,回归计算,绘制标准曲线,得线性方程为Y=152.92X+45.67,r=0.999 7。结果表明:进样量在0.200～4.000 μg 范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.2稳定性试验
制备供试液,含量测定项下室温放置,每隔一定时间进样10 μl,测定二苯乙烯苷峰面积积分值,RSD为0.51%,结果说明供试液室温放置,至少在24 h 内稳定性良好。
2.3 重复性试验
分别取何首乌细粉6份,按供试液制备方法制成供试液,进样10 μl,按含量测定方法测定何首乌中二苯乙烯苷的平均含量,RSD为0.43%,说明本实验方法的重复性较好 。
2.4 加样回收率试验
分别精密称取何首乌细粉20 mg 3 份,10 mg 3 份,0.05 g 样品中分别加入二苯乙烯苷对照品0.05 mg,10.00 g 样品中分别加入二苯乙烯苷对照品0.10 g,按供试液制备方法制成供试液,按含量测定方法测定,计算回收率为99.96%,RSD是0.16%,准确性较好。
2.5样品的含量测定
取10批何首乌细粉,按供试品制备方法制成供试液, 按含量测定方法测定, 以供试品峰面积积分值与对照品峰面积积分值计算,含量总平均值为2.93 mg,RSD是0.49%。
3 实验结论
何首乌临床应用极其广泛,实验结果表明:二苯乙烯苷在0.200～4.000 μg范围内呈良好的线性关系,样品分离度好,与阴性无干扰,且样品稳定性好。测量二苯乙烯苷的含量,宜采用高效液相色谱法作为测量手段,操作简单,结果准确,重现性好,可信度高。
[参考文献]
[1]吴立军,天然药物化学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2003:156.
[2]国家药典委员会,中华人民共和国药典[M].一部.北京:化学工业出版社,2005:430.
[3]赵陆华.高效液相色谱法分析中药成分手册[M].北京:中国医药科技出版社,1994:637.
[4]张纯,杨少麟.高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯甙的含量及其稳定性考察[J].中国中药杂志,1999,24(6):355-357.
(收稿日期:2010-05-12)
