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摘要:[目的] 研究一类罕见硫化氢阴性山夫登堡沙门菌腹泻菌株遗传克隆特征。 [方法] 收集、分析本地区参加全球沙门菌监测(GSS)腹泻病例中分离的山夫登堡沙门菌生化、编码SPI-1毒力岛基因(hilA、invA)和耐药特征;应用Riboprinter(r)(RP)DNA指纹图谱系统比较表型典型与不典型菌株的核糖体分型;通过Pluse Net China数据库中同型菌株的脉冲凝胶电泳(PFGE)图谱聚类比较分子型谱。
[结果] 2006年长宁区GSS监测病例分离出19株山夫登堡沙门菌,其中10株属于硫化氢阴性和SPI-1毒力岛缺失的表型变异菌株。RP分型证实发生变异的山夫登堡沙门菌与典型菌株间分属2个不同的克隆。Pluse Net China数据库将包括长宁区19株山夫登堡沙门菌在内的36株山夫登堡腹泻株共分18种PFGE带型。长宁区的表型变异株优势型分属4型(2株)和6型(6株),典型菌株的优势型分属11型(1株)、17型(4株)和23型(2株)。聚类分析显示,表型变异株的克隆在遗传相似度上高于典型株。
[结论] 分子溯源证实,SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡沙门菌变异菌株与典型菌株同样具有引发局部爆发的致病性。2006年长宁区分离的硫化氢阴性山夫登堡沙门菌变种腹泻株与2002年深圳市的1例食物中毒案例分离的2株SPI-1毒力岛缺失株存在同源性。
关键词: 山夫登堡沙门菌; 变种;Riboprinter(r)(RP); 脉冲凝胶电泳; 毒力岛; 溯源
中图分类号:R 117 文献标志码: A
Molecular tracing ofinfection source of rare H�2S negative strains ofSalmonella Senftenberg
HUANG Zheng1, XU Xue-bin2, JIN Hui-min2, Chen Min2,RAN Lu3, KAN Biao3(1.Shangahi Municipal Changning District Center for Hygeian Analysis,Shanghai 200051,China;2. Shangahi Municipal Center of disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China;3.China Center of Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China)
Abstract: [Objective] To investigate the genetic clone characteristics of rare H�2S negative strains of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Senftenberg(S. Senftenberg) .
[Methods] A retrospective analysis was performed to explore the characteristics of biochemical test, encoding Salmonella pathogenecity island gene 1(SPI-1) and antibiotic resistance of S. Senftenberg from diarrhea patients in Shanghai Global Salm-Surv(GSS). Ribotyping comparisons were made between typical and atypical strains of S. Senftenberg using Riboprinter� (RP) DNA finger printing technique. Using cluster analysis we compared the molecular subtyping of these strains with the same serotyping strains in China PulseNet dynamic database by PFGE.
[Results] Of 19 strains of S. Senftenberg isolated from Changningdistrict GSS-Surv hospital, there were 10 phenotype variant strains found to be H2S negative and lacking SPI-1.There were two different clones betweenvariant strains and typical strains, which was proved by RP Ribotyping. Thirty six strains of S. Senftenberg including 19 strains from Changningdistrict were divided into 18 PFGE typing-pattens by China PulseNet database. The PFGE subtype 4(2 strains) and 6(6 strains) were the predominant epidemic strains of variant strains ,the subtype 11(1 strains) ,17(4 strains)and 23(2 strains) were the predominant epidemic strains of typical strains in Changningdistrict. Cluster analysis showed the clone of variant strains was higher than that of the typical strains in genetic similarity.
[Conclusion] The molecular tracing of source confirms that variant strains of S. Senftenberg lacking SPI-1 can induce sporadic outbreak as the typical strains. There washomologous nature between H�2S negative variant strains of S. Senftenbergisolated from diarrhea patients in 2006 in Changningdistrict and two strains of S. Senftenberg lacking SPI-1from a food-borne disease outbreak in 2002 in Shenzhen.
Key words: S. Senftenberg; Variant; Riboprinter�(RP); PFGE; Salmonella pathogenecity island; Tracing source
长宁区疾病预防控制中心(CDC)作为上海第一批4个监测点之一,于2006年加入非伤寒沙门菌全球监测网络(GSS)。通过全市沙门菌病例监测发现,山夫登堡沙门菌血清型在2006年7―9月呈现一过性爆发的流行病学特征[1]。2006年从各哨点医院分离到19株山夫登堡沙门菌,其中10株为硫化氢阴性株。通过表型特征分析,利用2006―2007年全市收集GSS山夫登堡沙门菌的RP核糖体分型和脉冲凝胶电泳(PFGE)分子图谱资源,依靠国家疾病预防控制中心肠道病重点实验室的Pluse Net China数据库资源追溯此变异菌株的遗传学特征,为本地区非伤寒沙门菌监测和防制提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株 2006年从长宁区GSS腹泻病例中分离19株山夫登堡沙门菌;2006―2007年上海市4个GSS监测点分离的山夫登堡沙门菌共计39株。大肠埃希菌ATCC 25922为药敏试验质控菌株;布伦登卢普沙门菌H 9812作为PFGE的分子量标准菌株,由上海市CDC菌种保藏室提供。
1.1.2 培养基 亚硒酸煌绿增菌液(SBG)、罗伯特增菌液(RVS)、木糖赖氨酸胆酸盐琼脂平板(XLD)、CHROMagar(tm)沙门菌显色琼脂平板(CAS)、M-H琼脂平板、“H”相诱导软琼脂平板(上海科玛嘉科技有限公司);肠道双支糖综合鉴别管和其他辅助生化鉴定试剂购置于上海市CDC。以上增菌液和平板均避光保存在10℃以下环境中,在有效期内使用。
1.1.3 试剂和仪器 编码SPI-1毒力岛基因(hilA、invA)基因检测试剂盒(上海宝生生物科技有限公司);沙门菌分型诊断血清56种(成都生物制品研究所)、沙门菌分型诊断血清79种(S&A,Ltd,泰国);药敏分配器和14种抗生素纸片:四环素(TET)、头孢噻呋(EFT)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氨苄西林(AMP)、复方甲异恶唑(SXT)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(C)、氧氟沙星(OFX)、萘啶酸(NA)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、庆大霉素(CN)、链霉素(S)(Oxoid,英国);VitekAM-60自动生化鉴定仪(生物梅里埃,法国);菌液比浊仪(西门子,德国);限制性内切酶XbaⅠ(TaKaRa,日本);SeaKem Gold琼脂糖(Cambraex Bio Rockland,美国);脉冲凝胶电泳仪CHEF mapper system和凝胶成像系统GEL Doc2000(Bio-Rad,美国);Riboprinter(r)(RP)指纹图谱仪和酶切试剂(PvuⅡ kit)、样品处理包(DuPont Qualicon(tm),美国)。血清和抗生素纸片均在有效期内使用。
1.2 实验方法
1.2.1 非伤寒沙门菌病例监测 按照文献方法[2]和《上海市沙门菌病监测方案.2006年》中检测程序,每月完成辖区内3家定点临床医院的肠道门诊粪便样品的分离、菌株初筛鉴定和血清分型。系统生化反应符合并且血清抗原式符合[3,19:g,s,t:-]者鉴定为山夫登堡沙门菌。
1.2.2 抗生素敏感性试验 参照CLSI(NCCLS)2005年的操作规程,采用改良K-B法并根据抑菌圈直径判断敏感(S)、中介(I)、耐药(R)。头孢噻呋(EFT)K-B法的判断结果由Oxoid公司提供参考值。
1.2.3 RP指纹图谱分析 根据生化和基因表型的不同,选择2006年分离的8株山夫登堡沙门菌(长宁区山夫登堡沙门菌),进行PvuⅡ酶切图谱的分析比较,操作步骤按照厂商提供手册进行。
1.2.4 PFGE数据库 按照GSS方案要求,在中国CDC国家肠道病重点实验室按照Pulse Net规定的PFGE标准方法,挑选包括长宁区分离的19株山夫登堡沙门菌在内的共34株本市2006―2007年GSS分离的山夫登堡沙门菌腹泻株进行凝胶电泳、图谱分析和Bio Numerics(Version 4.0)软件聚类分析,同时将2002年深圳市从食源性爆发事件中分离的2株SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡沙门菌的PFGE图谱重新整合后,聚类形成山夫登堡分子分型数据库。
2 结果
2.1 长宁区19株山夫登堡沙门菌分型
表型典型菌株9株,hilA、invA基因和硫化氢均阳性;SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡不典型菌株10株,hilA、invA基因和硫化氢均阴性,涂片染色均为革兰阴性无芽孢杆菌,系统生化编码结果均提示为沙门菌属,血清分型结果符合山夫登堡抗原式。
2.2 上海市山夫登堡沙门菌病例监测
2006年上海市GSS山夫登堡病例在7月、8月、9月共分离30株,其中8月份高峰期14株。4个监测点3个月内以长宁区分离菌株最多(19/30);山夫登堡表型变异株也相对集中出现在7、8、9月,共11株,长宁区报告10株。2007年分离到的5株山夫登堡沙门菌没有表型变异株报告。2年内山夫登堡占本市非伤寒沙门菌病例血清型优势构成比由2006年的第3位下降至2007年的第6位。山夫登堡沙门菌典型与不典型菌株月度报告数对应流行曲线见图1。
图1 2006―2007年上海市GSS两类山夫登堡沙门菌监测情况
2.3 抗生素耐药率
包括长宁区在内,2006―2007年上海市GSS共39株山夫登堡沙门菌腹泻菌株,它们对四环素耐药率为79.5%(31/39),对萘啶酸的耐药率为2.6%(1/39),对其他12种抗生素均敏感。
2.4 RP指纹图谱分析
长宁区分离的19株山夫登堡沙门菌依据硫化氢产生和hilA、invA基因表型分成典型与不典型株两类。根据此原则各挑选4株(典型和不典型株)山夫登堡,同时使用PvuⅡ限制性内切酶对菌体染色体中的核糖体位点进行酶切和图谱分析比较。图谱显示,表型相反的两类菌株核糖体型的分型图谱分别对应为有显著DNA片段差异的2个克隆群(图2)。
注:1―SH 06163;2―SH 06124;3―SH 06142;4―SH 06100;(硫化氢+、hilA、invA基因+);5―SH 06062;6―SH 06160;7―SH 06061;8―SH 06072(硫化氢-、hilA、invA基因-);M―内标DNA分子量
图2 上海市长宁区山夫登堡沙门菌核糖体分型图谱(酶:PvuⅡ)
2.5 PFGE分型
2006―2007年上海市GSS病例的34株山夫登堡沙门菌的PFGE图谱与2002年深圳市食源性爆发事件中分离的2株SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡沙门菌的PFGE图谱构建成Pluse Net China山夫登堡型谱数据库。36株山夫登堡腹泻株共分18种PFGE带型。符合疑似爆发案例特征的优势带型为6型(6株)、17型(5株)、23型(5株)、4型(4株)、11型(3株),其余各型均为1株。同源聚类后产生A、B 2个克隆族,除1株23型外,4、5、6、7型中有11株SPI-1毒力岛缺失株的图谱聚类显示为同一克隆菌株,具有90%以上的遗传相似性特征;而余下的12个型22株菌的电泳图谱聚类显示有80%的遗传相似性,属于更大的一组在遗传上克隆特征相近的族特征(图3)。长宁区分离的10株山夫登堡表型变异株间存在高度的遗传相似性,优势型4型(2株)和6型(6株)仅有1个DNA片段的差异,并与深圳的2株组成同一个大的克隆族;另9株表型典型菌株优势型为11型(1株)、17型(4株)和23型(2株)。在符合爆发病例分子型特征中,长宁区曾经爆发过由6例6型病人和4例17型病人与存在95%同源的1例18型病人分别构成2例较典型的案例,而其他的优势型,包括4型、11型、23型在长宁区均属于高度散在的“爆发”。
3 讨论
GSS是重点针对非伤寒沙门菌引起“散在爆发”案例开展相关食源性溯源调查研究的全球合作项目[3]。山夫登堡是我国较常见的沙门菌血清型,在禽、畜等动物养殖场或屠宰场所易分离到,人群中带菌者亦常见,一般仅引起散发的食源或医源性个案病例,对多数抗生素敏感,出现爆发流行较少见。该菌高度散发的流行病学特征符合我们2002―2003年的食源性监测资料[4,5]。但2006年7―9月报告的30株腹泻菌株高度疑似为爆发病例,且同时伴有变异株病例的现象仅涉长宁(10例)和卢湾(1例)2区。对病例流行病学调查没有发现共同就餐点和明确的疑似食品,有不洁饮食史(海鲜类和肉制品)是此次一过性爆发的主要危险因素之一。在全年同步进行的对生鲜肉制品等食品进行食源监测中也没有发现与病例菌株匹配的山夫登堡典型株与变异株。
RP核糖体分型能分辨菌株间5-50 kb的DNA片段。PFGE对DNA相对分子质量的分辨率优于前者。虽然本市34株(2006年30株和2007年的4株)山夫登堡沙门菌的PFGE共呈16种带型,但聚类显示,分别属2个克隆族,与RP的分型结果存在一致性。PFGE 6型是变异株的优势型,17、23型是典型株的优势型,病例在长宁区有集聚性。推断长宁区山夫登堡沙门菌优势PFGE腹泻病例可能存在一个潜在而持续的污染源,由2个克隆族、3种优势分子型菌株构成“多点爆发”,逐步扩散形成流行趋势的腹泻病例。
有山夫登堡沙门菌生态学监测报道:1998―2002年,西班牙西南部地区的海岸水产养殖和加工厂的3种甲壳类贻贝在加工过程中受到了海水污染,使山夫登堡沙门菌形成生态循环能力造成持续而潜在的污染源,并随着贻贝类产品消费增加引发人的感染病例增加。此外,文献强调在含高盐量(300 g/L)海水中长期“顽强”存活的山夫登堡沙门菌中有少数出现了菌落形态不典型等变异。
2002年9月,扈庆华等发现参于编码SPI-1毒力岛的hil A和inv A基因均缺失的山夫登堡沙门菌与本次发现的山夫登堡不典型菌株的基因型特征完全相符。通过初步建成的中国Pulse Net网络将深圳的山夫登堡SPI-1缺失株的PFGE图谱整合到此次的山夫登堡爆发病例的图谱中重新聚类:深圳的2株山夫登堡沙门菌变异株之间存在1个DNA片段的差异,但和长宁区的10株变异株间聚集成同一遗传克隆。两者区别在于前者引起了1例局部食源性爆发案例,而后者引起较长时间的多点爆发案例。我们结合前期的流行病学调查结论及文献与菌型比对等间接和直接证据判断:本市2006年发生的由2个克隆型导致的山夫登堡沙门菌爆发病例,可能源于南方流入的寄生有山夫登堡沙门菌并同时能在宿主内完成生态循环和克隆变异变化的某些软体海产品。本市大型水产品批发市场毗邻长宁区,病例的发生和消亡在某种程度上符合区域内消费者对某种甲壳类水产品消费的变化规律。
大多数非伤寒沙门菌在自然界中缺少在特定宿主体内的生命循环,但如果在自然界的生存时间达1年甚至更久,就可能为其造就忍受环境变化获得新的适应环境的能力[7,8],由此带来的某些菌株表型(产硫化氢能力)改变,客观上降低了传统分离方法的敏感性和增加了分离的“不确定度”的影响。由于此次GSS实验室方案已经系统评价并选择沙门菌显色培养基分离目的病原,避免了使用SS或XLD平板作为首选培养基而产生的“漏检”现象[2]。
SPI-1毒力岛参与构建沙门菌的Ⅲ分泌系统,其中主要由hil A和inv A基因共同参与了沙门菌致病性毒力岛(SPI-1)的表达,其致病基因理论是目前公认的沙门菌“分子理论基础”。所以目前国内对沙门菌分子生物学检测的靶基因也多选择hilA和invA基因。本次我们发现的山夫登堡SPI-1毒力岛缺失株的hil A、inv A基因不能被商品化的检测试剂盒检出。但问题是,从2002年的深圳到2006年上海市发生的更多看似散发实则爆发的病例这一事实可以认为,这种变异株已经在合适的生态环境中找到适宜的宿主长期繁殖存在并能依靠其他致病性毒力岛(SPI-Ⅱ等)不断引起爆发病例;同时其hil A、inv A基因缺失的表型特征也给分子生物学靶基因的调整提供科学依据[9]。
基于上述研究,我们建议:由于复杂环境催化和自身遗传进化等因素,增加了沙门菌的某些血清型不断发生某种遗传变异的概率,对有能力进行沙门菌检测的实验室在实践中需要不断验证沙门菌常规方法和分子生物学方法在日常监测和应急检测中的效果,以满足不断增长的公共卫生体制建设和疾病预防控制的技术需要。
4 参考文献
[1]顾宝柯,袁政安,金汇明,等.上海市沙门菌病流行特征分析[J].环境与职业医学,2008,25(3):245-247.
[2]许学斌,顾宝柯,陈敏,等.沙门菌检测方法的优化[J].检验医学,2007,22(6):677-680.
[3]许学斌,顾宝柯,陈敏,等.上海市沙门菌流行特征分析[J].中国人兽共患病学报,2008,22(6):677-680.
[4]许学斌,顾宝柯,金汇明,等.免役磁珠法检测食品中沙门菌及分离菌株的耐药性[J].中国食品卫生杂志,2006,18(3):202-204.
[5]Young JL,Hyun JK,Cheng KP,et al.Characterization of Salmonella spp.Isolated from an Integrated Broiler Chicken Operation in Korea[J]. J Vet Med Sci,2007,69(4):399-404.
[6]Martinez U J,Liebana E.Use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize the genetic diversityand clonal persistence of Salmonella Senftenberg in mussel processing facilities[J]. Int J Food Microbiol. 2005,105(2):153-163.
[7]Martinez U J, Liebana E. Investigation of clonal distribution and persistence of Salmonella Senftenberg in the marine environment and identification of potential sources of contamination[J].FEMS Microbiol Ecol,2005,52(2):255-263.
[8]Nesse LL, Refsum T, Heir E,et al.Molecular epidemiology of Salmonella spp. isolates from gull,fish-meal factories,feed factories,animals and humans in Norway based on pulsed-field gel electrophoresis[J].Epidemiol Infect,2005:133(1)53-58.
[9]HU QH,Coburn B, DENG WY.et al. Salmonella enterica Serovar Senftenberg Human Clinical Isolates Lacking SPI-1[J].J Clin Microbiol,2008,46(4):1330-1336.
(收稿日期:2009-09-13)
