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[摘要] 目的分离尿路致病性大肠杆菌(UPEC)临床流行株，并进行序列分析。了解其基因变异情况。方法 自临床尿路感染标本中分离溶血性大肠杆菌10株。按C,enBank中的溶血素A(hlya)基因保守序列设计合成引物。以获得的UPEC基因组DNA为模板，用PCR方法扩增其hlya基因片段。对扩增的片段测序并进行同源性分析。结果扩增的hlya目的基因大小744 bp。经PCR鉴定表明获得正确的片段。测序结果显示。10个分离株DNA序列同源性高于99.7％，其与GenBank中的hlya基因序列的同源性为99％以上。10个序列中共发生13处碱基的替代，但均属于同义突变，没有碱基的插入与缺失。结论UPEC hlya基因高度保守。本研究在国内首次成功地扩增了UP，EC基因。为进一步研究hlya的结构、阐明UPEC的致病机制、探讨hlya作为特异性诊断靶点及保护性疫苗的研究奠定了基础。
[关键词]尿路致病性大肠杆菌；溶血素A；基因序列
[中图分类号]R378，21 [文献标识码]A [文章编号]1672-4208(2009)13-0034-02
尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic escherichia coli。UPEC)是人肾盂肾炎和其他泌尿系感染常见的病原菌，该菌常于患者机体免疫力下降时侵入泌尿系统引起尿路感染，也有患者是在接受泌尿系统器械检查等侵袭性操作而擦伤后，导致医院获得性感染。溶血素A可以引发人类溶血性尿毒综合征(hemolytie uremicsyndrome，HUS)，出现溶血性贫血，血小板减少性紫癜和急性肾衰竭，HUS患者死亡率为3％～10％。因此，UPEC分离株溶血素A基因的研究具有重要的理论意义和应用价值。国外已报道了UPEC菌株编码hlya的全基因序列，并分析了部分菌株的基因变异情况。而国内目前尚未见到hlya基因变异研究的相关报道。hlya基因的变异将导致其对宿主的致病性、抗生素的敏感性等发生改变，也对基因工程疫苗的研究带来极大挑战。为了解泰安地区中心医院UPEC流行菌株Mya基因的变异情况，本研究应用PCR技术体外扩增了hlya基因并进行序列测定和同源性分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 收集自2007年7月～2008年6月泰安市中心医院门诊、住院患者送检中段尿液标本分离培养的致病性溶血性大肠杆菌10株，同一病人只取首次分离株。
1.1.2 工具酶与试剂 DNA Molecular Weight Marker；TaqDNA聚合酶(Promega，美国)；dNTPs；蛋白酶K(Merck，德国)；DNA提取试剂盒(sigma，美国)；琼脂糖(Promega)、Tfis-CI、无水乙醇、苯酚、氯仿、氯化钠等均为国产分析纯产品。
1.1.3 仪器与设备 PTC―100 PCR扩增仪；DYY―11型电脑三恒多用电泳仪(北京)；电泳数字图像分析仪(美国)；高速冷冻离心机(KDC-160HR)；水浴恒温振荡器(江苏)；超净工作台；0.5 ml和1.0ml Eppendorf管、Tip头、水平电泳槽、微量移液器、透明胶带、点样板、微波炉(格兰仕)。
1.2 方法
1.2.1染色体DNA的提取 染色体DNA提取采用SDS-蛋白酶k-酚／氯仿抽提法。
1.2.2 目的基因的PCR扩增和纯化 根据GenBank中报道的hlya基因序列设计引物，引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。上游引物P1：5’-CGAATrCTGTTACTGGTCGGGCAGACTA-3’；下游引物P2：5’-CGGATCCATCAGACGGGCTGGTCATYGT-3’。以抽提DNA为模板进行PCR，按如下反应体系进行。在O.5 ml Eppendoff管中依次加入下列成分：缓冲液5.Oμl，dNTPs 2.0μl，上、下游引物各2.0μl，模板DNA 2.Oμl，Taq酶1.Oμl，加双蒸水36.0μl至终体积50μl。热启动法进行PCR，94℃预变性10min后，94℃变性60 s，56℃退火40 s，72℃延伸30 s，循环35次后再延伸5 min。PCR产物经酚和(或)氯仿抽提法回收，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 DNA测序 10个菌株的hly8基因进行序列测定，由上海博亚生物技术有限公司完成测序工作。
1.2.4 序列分析 序列分析应用DNAStar软件完成。将测序结果与Internet网上的Genbank数据库进行blast同源性比较分析。
2 结果
2.1 PCR扩增目的片段 以UPEC基因组DNA为模板进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一约744 bp的特异扩增带，片段大小与理论预期一致。其中，M为DNA分子量标准(d12000)，1-10为PCR产物，11为阴性对照。
2.2序列测定与同源性比较 将10个UPEC的hlya基因扩增片段送上海博雅生物工程技术有限公司测序，结果显示hlya基因保守区序列全长744 bp，含完整的开放阅读框架，包含启动子和密码终止子，预测编码248个氨基酸。用DNA Star软件对所得的hlya序列进行比较分析。结果显示10个UPEC分离株hlya基因高度保守。与GenBank中已知大肠杆菌的hlya基因序列进行比较，其同源性达99％以上，与GenBank AJ488511.1的大肠杆菌536株的同源性达99.7％以上。1、3、10株372位的碱基G被A取代，氨基酸密码子由GGc转换为GGu，但都编码甘氨酸；1、3、10株660位的碱基G被c取代，氨基酸密码子由CGC颠换为CGG，但都编码精氨酸。2、4、5、6株660位的碱基G被T取代，氨基酸密码子由CGC颠换为CGA，但都编码精氨酸。7、8、9株660位的碱基G被A取代，氨基酸密码子由CGC转换为CGU，但都编码精氨酸。此变异均为无意义突变。
3 讨论
近年来，随着免疫抑制剂和大量广谱抗菌药物的应用，多重耐药菌株感染病例有增加的趋势。国外对UPEC感染过程给予了极大的关注，并从多角度、多层次地研究毒力、致病机制及其防治措施等。UPEC是人肾盂肾炎和其他泌尿系感染常见的病原菌，UPEC可顽固地存在于膀胱组织中，从而成为复发性尿路感染的难治根源，严重者可引起溶血性尿毒综合征(HUS)，对患者肾脏造成不可恢复性损伤，病死率高。尿路感染发病率高，治疗费用高昂。在美国，大约三分之一的女性在65岁以前患过一次以上的尿路感染(urinary tract infections，UTI)，部分女性每年要患多次UTI。尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是70％～95％社区获得性和50％医院获得性UTI的病原菌。UPEC主要存在于肠道、阴道口和尿道口周围。UPEC所具有的毒力因素可使其在尿路繁殖并避开宿主的防御反应。
本研究获得了10株UPEC hlya保守基因片段，测序分析结果显示，其与GenBank中已知的hlya基因序列的同源性达99％以上，与AJ488511.1 536株的同源性达99.7％以上。说明该基因在不同株之间高度保守，与国外报道相似。对UPEC的主要毒力因素α-溶血素编码基因变异性的研究，对于深入了解其致病及耐药机制、研制相应的基因工程疫苗等均具有重要的指导意义和应用价值。
