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[摘要]目的 探讨大蒜素对人肺癌A549细胞周期的影响及其与周期特异性抗癌药物紫杉醇联合使用的抗肿瘤作用。方法MTF法检测大蒜素对肺癌细胞的增殖抑制作用，流式细胞仪检测细胞周期改变，Annexin V－FITC标记法定量检测细胞凋亡，观察大蒜素与紫杉醇联合使用后药物对细胞毒活性的改变。结果大蒜素可明显抑制A549细胞生长，72h药物半数抑制浓度(IC50)为18.55μg・ml-1；9.30μg・ml-1大蒜素作用A549细胞24h后，与对照组比较，G0/G1期细胞的百分率明显减少，而G2/M期明显增加(P＜0.05)，大蒜素与紫杉醇联合使用后，紫杉醇72hIC50值由单独应用的9.21μg・ml-1下降至1.07μg・ml-1；细胞凋亡率由53.2％增至97.0％。结论大蒜素可将肺癌A549细胞阻滞于G2/M期，大蒜素与紫杉醇联合使用可能具有协同抗肿瘤作用。
[关键词]大蒜素；肺癌细胞A549；细胞周期；紫杉醇
[中图分类号]R734.2；Q813.1 [文献标识码]B [文章编号]1671－7562(2007)04－0295－04
在肿瘤化疗过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，亦损伤正常细胞。因此，最大限度地发挥抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少对正常细胞的毒性越来越受到重视。大蒜是百合科葱属植物的磷茎，主要的生物活性物质是其特有的含硫化合物，包括甲基烯丙基硫、二烯丙基三硫、二烯丙基四硫、二烯丙基硫代硫酸酯。二烯丙基三硫又名大蒜素。研究发现大蒜素具有抗肿瘤作用，如可能改变调节致癌活性有关的酶活性，参与提高肿瘤患者的免疫功能，阻滞细胞周期，介导细胞凋亡和分化等。但大蒜素与抗癌药物联合应用的研究不多，本研究将大蒜素作用于人肺癌A549细胞，以研究大蒜素对肿瘤细胞的阻滞作用以及与紫杉醇联合应用对肿瘤细胞的杀伤作用。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
人肺癌细胞系A549细胞、Annexin V细胞凋亡试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供，大蒜素注射液由上海禾丰制药有限公司生产，紫杉醇由四川太极制药有限公司生产。RPMI 1640培养基和胰酶购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝(MTr)、DMSO购自Amresco公司，96孔板购自Costar公司，碘化丙啶(PI)、RNase为Fluka公司产品。FACSean(B.DUSA)流式细胞仪，Bio－RAD Model550(B.DUSA)酶标仪。
1．2 细胞培养
将A549细胞接种在50ml培养瓶中，用含15％小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，细胞贴壁80％时传代，1周传2－3次。实验用细胞为接种24h后的对数生长期细胞。
1．3 MTT法检测大蒜素和紫杉醇对肺癌细胞A549的抑制作用
消化收集对数生长期细胞并调整成浓度为5×104ml-1的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，24h后加入以RPMI 1640培养液配置的大蒜素，终浓度分别为80、40、20、10和5μg・ml-1，同时设立含RPMI1640全培养基的空白对照组。同法配置紫杉醇，终浓度分别为40、20、10、5和2.5μg・ml-1。每一浓度设5个复孔，分别继续培养24、48和72h；弃上清液后每孔加MTr50μl，浓度为1mg・ml-1，混匀，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育4h；弃上清液后每孔加150μl的DMSO溶解蓝紫色颗粒，以酶标仪检测波长490 nm的每孔吸光度值(A值)。实验重复2次，计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率＝(1－实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％。采用LOGIT药物浓度抑制统计分析软件计算IC50值。
1．4 细胞周期分析
用流式细胞仪检测，取生长状态良好的细胞接种在大方瓶中，培养至密度达60％－70％时分别加入不同浓度大蒜素，设立正常对照组，培养72h收集细胞。收集的细胞以PBS洗3次，以70％乙醇4℃固定过夜，1000 r・min-1离心5min，弃去乙醇，PBS洗3次后，加入10μg・ml-1的RNase于37℃消化0.5 h，加入50μg・ml-1的PI于4℃染色0.5h，流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析，所用软件为Cellqest。
1．5 细胞凋亡检测
以Annexin V－FITC标记法定量检测紫杉醇和大蒜素联合应用时细胞凋亡的变化。将终浓度为IC50值的大蒜素和紫杉醇分别加入肺癌细胞A549，培养72h；另一组细胞先经浓度为1/2IC50值的大蒜素诱导24h后再加浓度为IC50值的紫杉醇作用72h，并设立正常对照组。细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，PBS清洗2次，于4℃ 2000 r・min-1离心5min，收集(1－5)×105细胞，吸取250μl的Binding Buffer和250μl的灭菌去离子水，混匀；用上述500μl的Binding Buffer悬浮细胞，加1μl Annexin V－FITC，室温下混合，加入5μl浓度为20 mg・L-1的PI，避光室温反应5min，用流式细胞仪分析(绿色荧光用FL2检测，红色荧光用FL1检测)。
1．6 两药联合应用72h时紫杉醇IC50值的变化
依据1.3所测的大蒜素和紫杉醇抑制肺癌A549细胞72h的IC50值，一组应用终浓度为IC50值大蒜素诱导培养细胞24h后，紫杉醇再作用于A549细胞72h检测紫杉醇IC50值的变化；另一组将IC50浓度大蒜素与紫杉醇同时作用于A549细胞检测紫杉醇72h IC50值的变化。
1．7 统计学处理
数据采用x±s表示，两组间均数比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析LSD方法，所有数据采用SPSS 10.0统计软件包处理，P＜0.05为有统计学意义。 2 结 果
2．1 大蒜素和紫杉醇单独应用对肺癌细胞A549生长的抑制作用
对照组细胞呈正常对数生长，大蒜素对A549细胞生长有明显抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24和48h时作用强度相对较弱，抑制率分别为2.28％－53.89％和0.70％－77.20％，72h时抑制作用明显，抑制率为7.60％－92.51％，大蒜素抑制A549细胞IC5072h为18.55μg・ml-1。紫杉醇对A549细胞生长亦有明显的抑制作用，24h时作用强度相对较弱，抑制率为26.26％－59.47％，48和72h抑制率分别为23.17％－95.42％和26.59％－97.09％，紫杉醇抑制A549细胞IC5072h为9.21μg・ml-1。以此为依据后面实验即以18.55和9.21μg・ml-1作为大蒜素和紫杉醇的浓度参数。
2．2 大蒜素对细胞周期的影响
A549细胞在不同浓度大蒜素诱导72h后细胞周期发生了明显变化，主要表现为G0/G。期细胞逐渐减少，同时G2/M期细胞逐渐增加，而S期细胞无明显变化。
2．3细胞凋亡率
流式细胞仪结合Annexin V－FITC标记法检测凋亡率，单独应用大蒜素18.55μg・ml-1和紫杉醇9.21μg・ml-1作用A549细胞72h时，细胞凋亡率分别为82.9％和53.2％；A549细胞先经大蒜素9.30μg・ml-1诱导24h后再加紫杉醇9.2lμg・ml-1作用72h，细胞凋亡率增至97.0％。结果显示大蒜素可诱导细胞凋亡，并增强紫杉醇对肿瘤细胞的细胞毒活性。
2．4 大蒜素与紫杉醇协同抗肿瘤作用
A549细胞先经大蒜素(18.55μg・ml-1)诱导24h后再与紫杉醇联合应用时，紫杉醇72h的IC50值由原来单独应用的9.21μg・ml-1下降到1.07μg・ml-1，杀伤效率提高7.61倍；A549细胞中同时加入大蒜素与紫杉醇，紫杉醇72h的IC50值亦由原来单独应用的9.21μg・ml-1下降到2.34μg・ml-1，杀伤效率提高2.94倍，提示大蒜素与抗癌药物紫杉醇联合应用，增强了紫杉醇对肿瘤细胞的细胞毒活性，并提示提前应用大蒜素效果更佳。
3 讨 论
肿瘤发生是一个多步骤的复杂过程，细胞的增殖分裂失调是肿瘤发生的基础。随着对凋亡研究的深入，人们认识到促进肿瘤细胞凋亡是有效治疗肿瘤的途径之一。本研究采用不同浓度的大蒜素作用于人肺癌细胞系A549后，结果显示肿瘤细胞生长受到明显抑制，大蒜素可诱导细胞凋亡。流式细胞仪检测发现S期细胞数量明显减少，细胞周期被阻滞在G2/M期。细胞周期是一个复杂有序并受严格调控的过程，细胞通过两个限制点(G1/S期和G2/M期)保证细胞的复制。细胞周期调控机制的失控，特别是G1/S期和G2/M期限制点的突变在细胞癌变过程中起着至关重要的作用。G2/M期阻滞可以增加损伤DNA的修复，减少染色体畸变。本实验证实大蒜素可选择性地将细胞周期阻滞于G2/M期，保护细胞不因DNA损伤而突变产生异常增殖。大蒜素的肿瘤细胞M期阻滞作用，对临床应用大蒜素抗肿瘤，尤其与M期特异性化疗药物协同抗肿瘤有重要的理论意义。
紫杉醇是四环二硝酸胺类化合物。它作用于细胞分裂过程中形成纺锤体的微管蛋白，能诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配与微管稳定，从而阻止肿瘤细胞的生长，特异作用于G2/M期。最近有研究指出，在化疗药物的应用上，周期特异性药物对杀伤处于此药敏感时相的肿瘤细胞有重要意义。如果能延缓肿瘤细胞周期进程，阻止细胞从某一时相进入下一时相，导致细胞暂时性蓄积，此时如给予对这一时相具有杀伤作用的药物将能明显增效。Arora等研究发现P－糖蛋白的过度表达是导致肿瘤细胞多耐药而影响化疗疗效的主要原因，大蒜素可将耐药细胞P－糖蛋白的表达降至正常水平。本研究结果显示，大蒜素与抗癌药紫杉醇联合使用，能明显增强其对A549细胞的细胞毒活性，且A549细胞先经大蒜素处理后再加入紫杉醇，其疗效优于大蒜素和紫杉醇同时作用，此结果可能与大蒜素将肺癌细胞A549阻滞于G2/M期，使这一时相的细胞蓄积从而有利于增强紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤作用有关。本研究为临床应用大蒜素治疗肺癌提供了实验依据，并提示大蒜素可作为新的非毒性调节剂，在肿瘤化疗中与其他化疗药物联合应用，以提高肿瘤细胞对药物的敏感性，增强疗效。
