【www.zhangdahai.com--调研报告】
摘 要：目的：建立玉屏风汤剂及其组方饮片的多糖含量测定方法，并对多糖含量及提取率进行分析。方法：采用硫酸－苯酚法测定。结果：10批玉屏风汤剂的多糖含量为0.984～1.746g/剂；黄芪、防风、白术饮片的多糖含量分别为0.0816～0.1174g/g生药、0.0300～0.0396g/g生药、0.0203～0.0254g/g生药；单味饮片汤剂的提取率分别为50.43％～69.73％、43.67%～53.98％、25.59%～38.42％；全方汤剂的提取率为40.57%～62.06％；玉屏风汤剂的多糖含量略低于黄芪、防风、白术单味饮片汤液的多糖含量之和。结论：对玉屏风汤剂及其组方饮片的多糖含量和提取率进行研究，为玉屏风传统汤剂及其组方饮片的多糖含量的研究提供一定的参考。
关键词：玉屏风汤剂；多糖；硫酸-苯酚法
中图分类号：R927.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）09-0021-03
玉屏风源于《丹溪心法》，由黄芪、防风、白术（炒）三味药组成。功能益气、固表、止汗，用于表虚不固，自汗恶风，面色白光白，或体虚易感风邪者［1］。多糖广泛存在于自然界，是多种中草药的有效成分之一［2］，黄芪、防风、白术中均含有一定量的多糖成分。药理实验表明，黄芪多糖作为一种免疫抑制剂，具有保护急性心肌缺血，对抗心率失常，改善微循环的作用［3］；防风多糖具有增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能［4］，显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的功能［5］；白术多糖能调节免疫功能［6］。目前，用硫酸－苯酚法测定中药复方汤剂中的多糖含量已有相关文献报导［7］，但对组方不同饮片的多糖含量及提取率研究的报导较少。本实验针对饮片不同质地提取率的差异，在前期玉屏风方饮片及汤剂组方成分含量相关性研究的基础上［8］，进一步采用硫酸－苯酚法，对玉屏风汤剂及其组方饮片的多糖含量和提取率进行研究，为玉屏风传统汤剂物质基础的研究提供一定的参考。
1 仪器与试药
TU-1000型紫外可见分光光度计（北京市通用仪器设备公司），TG16-WS台式高速离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司），MM-2型快速旋涡振荡器（江苏省姜堰市沈高康健生化器具厂），无水乙醇、苯酚和浓硫酸均为分析纯，葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）。10批黄芪、防风、白术（炒）饮片，分别购于广东康美药业中药饮片厂、广州市药材公司、广州致信药业中药饮片厂等多家药材公司。
2 方法与结果
2.1 试剂配制
5%的新蒸苯酚溶液：取苯酚试剂加热融解，置圆底烧瓶中采用重蒸镏法收集185℃的馏分，重复三次得到较纯的苯酚溶液，趁热精密吸取25mL溶液于500mL棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，振摇混匀，置冰箱避光保存［9］。
2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 全方汤剂供试品溶液的制备
按《中国药典》的处方配比（黄芪18g、防风6g、白术（炒）6g），取黄芪饮片45g、防风饮片15g、白术（炒）饮片15g，加8倍水浸泡30min，煎煮40min，趁热滤过。再在滤渣中加6倍水煎煮30min，趁热滤过，合并两次滤液，浓缩，置于500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为全方汤剂（即每1mL汤剂含0.15g生药）。精密吸取1mL全方汤剂于10mL试管中，滴加无水乙醇4mL（速度约2d/s），边滴边置于快速旋涡振荡器上振荡，密封，冷藏放置24h，取出，在2500rpm离心15min，弃去上清液，沉淀加入80％乙醇2mL，充分混合，在2500rpm离心15min，弃去上清液，沉淀加入无水乙醇2mL，充分混合，离心，弃去上清液，反复处理三次，沉淀用热蒸馏水溶解，放凉。
然后置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，振摇混匀，作为全方浓多糖溶液。滤过，精密吸取1～2mL全方浓多糖溶液，置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
2.2.2 单味饮片汤剂供试品溶液的制备
分别取黄芪45g、防风15g、白术15g，按全方汤剂方法制备，置于500mL容量瓶中，加水稀释至刻度。取黄芪单味饮片汤剂10mL，浓缩至约4mL，置于5mL容量瓶中，放凉，加水稀释至刻度，作为黄芪单味饮片浓汤剂（即每1mL汤剂含0.18g生药）；分别取防风、白术单方汤剂各50mL，浓缩至约4mL，置于5mL容量瓶中，放凉，加水稀释至刻度，作为防风、白术单味饮片浓汤剂（即每1mL汤剂含0.3g生药）。精密吸取上述单味饮片浓汤剂各1mL于10mL试管中，从“滴加4mL无水乙醇至振摇混匀”按2.2.1项下操作，得单味饮片浓多糖溶液。滤过，精密吸取黄芪单味饮片浓多糖溶液1～2mL，防风、白术单味饮片浓多糖溶液2～5mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
2.2.3 单味饮片粉末供试品溶液的制备
分别取黄芪、防风、白术粉末各6g，精密称定，加水200mL浸泡30min，煎煮两次，每次2h，趁热滤过，合并两次滤液，浓缩，置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为单味饮片粉末提取液（即每1mL提取液含0.12g生药）。分别精密吸取各提取液1mL于10mL试管中，从“滴加4mL无水乙醇至振摇混匀”按2.2.1项下操作，得单味饮片粉末浓多糖溶液。滤过，精密吸取黄芪单味饮片粉末浓多糖溶液1～2mL，防风、白术单味饮片粉末浓多糖溶液2～5mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
2.3 线性关系考察
精密称取葡萄糖对照品0.1003g置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液1，2，4，6，8，10mL于100mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为系列浓度的对照品溶液。精密吸取各浓度的对照品溶液2mL，加入5％的苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，超声处理5min，于40℃恒温箱放置20min，冷却至室温，同时用2mL蒸馏水按上述条件处理作为空白溶液，在490nm波长处测定吸光度。以葡萄糖的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得标准曲线方程A＝9.965C+0.00462（r=0.9998），线性范围为0.01003～0.1003mg/mL。
2.4 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液2mL，从“加入5％的苯酚溶液1.0mL至在490nm波长处测定吸光度”按2.3项下操作，重复测定5次，结果对照品溶液吸光度的RSD为0.45％，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液2mL，从“加入5％的苯酚溶液1.0mL至作为空白溶液”按2.3项下操作，在490nm波长处，分别在0，10，20，30，40，50，60min测定吸光度，结果供试品溶液吸光度的RSD为3.02％，表明供试品溶液在1h内较稳定。
2.6 重现性试验
取同一批玉屏风饮片5份，按全方汤剂供试品溶液的制备方法制备，精密吸取各供试品溶液2mL，从“加入5％的苯酚溶液1.0mL至在490nm波长处测定吸光度”按2.3项下操作，结果供试品溶液吸光度的RSD为7.32％，表明汤剂煎煮的重现性基本可行。
2.7 加样回收试验
分别精密吸取已知含量的全方汤剂（0.984g/剂）0.5mL，精密加入葡萄糖对照品溶液（5.01mg/mL）0.5mL，按2.2.1供试品溶液的制备及2.8样品测定项下平行操作5份，结果见表1。
2.8 样品测定
分别精密吸取上述各供试品溶液2mL，从“加入5％的苯酚溶液1.0mL至在490nm波长处测定吸光度”按2.3项下操作，并按照相应的稀释倍数计算多糖含量。10批玉屏风汤剂多糖含量测定结果见表2。全方每剂按黄芪18g，防风6g，白术6g计，以单味含量（g/g生药）折算全方饮片、全方汤剂多糖含量，并计算提取率，结果见表3。
3 讨论
本实验用硫酸－苯酚法测定多糖含量，方法简便、快速，但要求操作规范，否则对实验结果有很大影响。在加无水乙醇沉淀多糖时，可用酸式滴定管以2d/s的速度滴加无水乙醇，同时置快速旋涡振荡器上振荡，使沉淀出来的多糖呈疏松絮状，可以避免把其它大分子物质包裹于多糖内部，影响含量测定结果。加入浓硫酸显色时，应悬空移液管，垂直快速加入浓硫酸，否则反应不完全，测定结果明显偏低，与文献报导一致［10］。显色后，样品立刻超声处理5min代替手工振摇，是考虑到加入浓硫酸后，样品温度会迅速升高，且用超声仪处理可使样品在混合程度和时间上更容易控制。供测定用葡萄糖对照品溶液及全方汤剂供试品溶液在400~600nm波长范围内扫描度，均在490nm处有吸收峰，故选择490nm为测定波长。
在实验过程中，曾用不同浓度的汤剂进行醇沉，结果发现如果浓度太高，醇沉出来的多糖为褐色或棕褐色，呈紧密块状，且含量测定结果偏高，可能是醇沉时把其它物质也包裹在多糖里面；浓度太低，则无法沉出多糖或只能沉出极少量的多糖，且含量测定结果偏低；本实验根据汤剂的浓度进行整数倍的浓缩，最后选定以下浓度进行醇沉：全方汤剂为0.15g生药/mL，黄芪单味饮片汤剂为0.18g生药/mL，防风、白术单味饮片汤剂为0.3g生药/mL，单味饮片粉末提取液为0.12g生药/mL时，结果沉淀出来的多糖为乳白色或淡黄色，呈疏松絮状，含量测定结果的重复性和回收率试验均较理想。
由于汤剂重复性相对较差，因此，每批汤剂至少应煎煮3份，以减少误差。本实验测定了10批玉屏风汤剂的多糖含量，其多糖含量为0.984～1.746g/剂。黄芪、防风、白术饮片的多糖含量分别为0.0816～0.1174g/g生药、0.0300～0.0396g/g生药、0.0203～0.0254g/g生药，表明三种饮片中，黄芪的多糖含量最高；单味饮片汤剂的提取率分别为50.43％～69.73％、43.67％～53.98％、25.59％～38.42％，白术单味饮片汤剂的多糖提取率明显比黄芪和防风低，可能与白术质地坚实有关；全方汤剂的提取率为40.57％～62.06％；全方汤剂的多糖含量略低于黄芪、防风、白术单味饮片汤剂的多糖含量之和。原因可能是煎煮单味饮片汤剂时，饮片与水能更充分地接触，故多糖的提取量更高。
本实验对玉屏风汤剂及其组方饮片的多糖含量和提取率进行研究，为玉屏风传统汤剂的研究提供一定的参考，但其多糖的成分、比例、药理作用等尚待进一步研究。
参考文献：
［1］ 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005：409.
［2］ 季宇彬主编.中药多糖的化学与药理［M］.北京：人民卫生出版社，2005.
［3］ 赖斌，卞红梅.中药及天然药物中多糖类成分药理研究概况［J］.首都医药，2001，8(5)：52-53.
［4］ Shimizu N，TomodaM，GondaN，et al. Chem Pharm Bull［J］.1989，37(11)：3054.
［5］ 李江，陆蕴如，张桂燕.防风多糖的研究［J］.中草药，1999，30(9)：652.
［6］ 汤新慧.白术多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.中医研究，1998，11(2)：7-9.
［7］ 李毅，赵淑芝，周淑芳，等.天年合剂总多糖的含量测定及薄层色谱鉴别［J］. 中国药业，2006，15(1)：35-36.
［8］ 黄月纯，尹雪，魏刚.玉屏风方饮片及汤剂中毛蕊异黄酮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量相关性研究［J］.中国实验方剂学，2008，（6）.
［9］ 细敏，唐小异，刘胜姿，等.白术多糖葡萄糖的含量测定［J］.湖南师范大学学报（医学版），2004，1(1).
［10］ 张立，马琼，何永利，等.灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定［J］.2004，35(2)：167.
（责任编辑：陈涌涛）
