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摘 要：目的：考察利用简便方法提取和分离新疆光果甘草异黄酮类成分光甘草定的工艺。方法：分别利用二氯甲烷、甲醇和乙醇等3种溶剂提取法，对光果甘草中光甘草定的提取率进行考察；再利用硅胶柱层析和制备薄层层析法对光甘草定进行分离纯化，对文献工艺进行简化。结果：利用3种不同提取方法获得的光果甘草总黄酮粗提物中，光甘草定的含量分别达2.9%（出膏率2.5%）、2.6%（4.8%）和2.3%（4.5%）。结论：用乙醇提取光果甘草总提取物具有提取率高、安全和环保等优点；利用硅胶柱层析法对粗提取物中的不同极性组分进行分离、再利用制备薄层法进行分离纯化，在快速制备高纯度的光甘草定中具有一定参考价值，此方法比文献工艺简便易行。
关键词：光果甘草；光甘草定；提取分离
中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）09-0027-02
近期报道显示，甘草黄酮类化合物(licorice flavonoid compounds)具有较强的抗氧化保护作用，并能抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡作用，从而成为植物类天然生物活性成分的研究热点之一［1］。甘草黄酮中，光果甘草中所含的异黄酮类成分-光甘草定(Glabridin，图1)更引起关注。光甘草定在体内外药理实验中显示较强的神经保护作用［2］及明显的抗动脉粥样硬化和一定的降血脂、降血压作用［3-5］，在心脑血管疾病防治药物的研究中显示出良好的研究前景。
本研究在前期工作的基础上［6］，利用不同方法对新疆光果甘草总黄酮进行提取和含量测定，考察不同提取法对其中的异黄酮类成分光甘草定的提起效率；再对光甘草定进行分离纯化和结构鉴定，对其文献提取工艺进行明显简化和优化。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
甘草根（Glycyrrhiza glabra L，新疆巴出县采摘，新疆医科大学药学院天然药物化学/生药教研室鉴定），硅胶100目（青岛海洋化工集团），甲醇（天津市恒昊科工贸有限公司），二氯甲烷(天津市南大化学试剂厂)，乙醇(天津市北方天医化学试剂厂)，甲醇(天津市北方天医化学试剂厂)，甲苯(天津市北方天医化学试剂厂)，丙酮(天津市北方天医化学试剂厂)，环己烷(杭州炼油厂)，乙醚(上海马陆制药厂)。
1.2 仪器
定性鉴别用TLC板（Silicagel 60 F254 MERCK），制备型TLC板（20×20cm，Silicagel 60 F254，厚度约为0.8~1mm，MERCK），紫外灯（观测TLC斑点，株式会社东京本乡），电子天平（DT200型，常熟市衡器厂），数字式熔点测定仪（WRS-1A，上海精密科学仪器有限公司）；核磁共振仪（�1H NMR，Varian 600，CDCl3），红外光谱仪（IR，Merck，样品用KBr成片），HPLC仪(Merck L-3000/colomne Lichrospher-100 Diol，5μm，25 cm)，UV仪 (UV Kontron)；质谱仪（M.S quadripolar VG Platform II）。
1.3 光甘草定的提取分离
1.3.1 光果甘草粗提物的制备
利用3种方法对光果甘草总黄酮粗提物进行制备，并比较提取效果。
（1）取甘草根粉末1kg，用二氯甲烷回流提取3次，合并3次提取液，减压浓缩至干，得棕色浸膏25g（提取物I）。
（2）取甘草根粉末1kg，用95%甲醇回流提取3次，合并3次提取液，减压浓缩至干，得棕色浸膏45g（提取物II）。
（3）取甘草根粉末1kg，用95%乙醇回流提取3次，合并3次提取液，减压浓缩至干，得棕色浸膏48g（提取物III）。
对各提取物中光甘草定含量进行测定（结果见表1）。
1.3.2 光甘草定的分离纯化
取2g提取物I，装载硅胶层析拄，以CH2Cl2/MeOH（9∶1）为洗脱液进行分离，得到6个组分。其中组分5具有光甘草定的特征（硅胶薄层Rf值为0.42）。将组分5用制备型薄层板进行分离（展开剂为CH2Cl2/MeOH=91∶9），收集Rf值为0.42的色带，并用丙酮提取，减压浓缩至干，用甲苯/环己烷混合溶剂（3∶1）进行重结晶，得Glabridin纯品。
1.3.3 光果甘草粗提物和光甘草定的鉴定
按文献方法［7］，用HPLC对光果甘草3种总提取物进行光甘草定的含量测定，并对光甘草定纯品进行初步HPLC鉴定（图2）；利用四大广谱法对光甘草定进行结构鉴定，并与文献值进行对照。
2 结果
2.1 光果甘草粗提物中光甘草定的含量测定
按文献方法［7］对光果甘草3种粗提物中的光甘草定进行含量测定，结果如表1。
表1 3种光果甘草粗提物中光甘草定的百分含量
光甘草定百分含量（％）出膏率（％）提取溶剂光甘草定的提取量（g）
提取物I2.92.5二氯甲烷0.725
提取物II2.64.595%甲醇1.170
提取物III2.34.895%乙醇1.104
表1中的数据显示，利用二氯甲烷提取得到的提取物Ｉ中光甘草定的百分含量较高（达2.9%），但利用此法时光甘草定的提取量小，即从1kg甘草中可获得0.725g光甘草定；利用甲醇提取得到的提取物II中，虽然光甘草定的含量稍低（2.6％），但光甘草定的提取量较大（1.170g/1kg甘草），即提取较彻底；利用乙醇提取时，效果与甲醇提取的类似。考虑到环保和安全等问题（如甲醇的毒性和二氯甲烷对环境的污染），建议利用乙醇提取法更适合于工业化生产光甘草定提取物。
2.2 光甘草定的结构鉴定
图1 光甘草定的化学结构式
光甘草定（1，3-Benzenediol-4-(3，4-dihydro-8，8-dimethyle2H，8H-benzo(1，2b∶3，4b′(dipyran-3-yl；glabridin）：微黄色粉末，熔点233.3-235.5℃。TLC∶Rf=0.42(展开剂：CH2Cl2/9%MeOH，Silicagel60F254)。D=+9，5°(c∶0，315/CHCl3)；UVmax.(EtOH)∶230，282，322(sh)nm(图1)。EI-MSm/z(rel.int.，%)∶324(M�+，31)，309(M�+-CH3，100)，187(14)，173(52)，136(8)；分子式C20H20O4，计算值∶C，74.06；6.21.测定值∶C，74.24；H，6.27。IR(KBr)max∶3374，1620，1607，1596，1519cm�-1。�1H-NMR(400MHz，CDCl3)∶7.68(1H，brs，OH)，7.48，(1H，brs，OH)，6.91(1H，d，J=8.2，6′-H)6.81(1H，d，J=8.2，5-H)，6.64(1H，d，J=9.9，4″-H)6.46(1H，d，J=2.2，3′-H)，6.39(1H，dd，J=8.2，2.2，5′-H)，6.33(1H，d，J=8.2，6-H)，5.55(1H，d，J=9.9，3″-H)，4.39(1H，ddd，J=1.8Hz，3.2，10.3，2-H)，4.01(1H，dd，J=10.3，10.3，2ax-H)，3.52(1H，m，3ax-H)，2.99(1H，dd，J=11.0，15.74ax-H)，2.83 (1H，m，4-H)，1.42，1.40(3Heach，s，5″-and6″-CH3)。以上数据与光甘草定的文献数据一致［6］。
图2 光甘草定在甘草脂溶性总提取物中的紫外吸收特征（HPLC仪，二极管陈列检测器）
3 讨论
光甘草定是光果甘草中的主要异黄酮类成分之一。本研究对光甘草定的提取和纯化工艺进行研究，对文献工艺进行简化，并提出适合于工业化生产的提取方法。
Vaya等用利用甲醇提取甘草总提物，再利用Al2O3柱层析分离法和反复用硅胶柱层析法获得光甘草定。此方法的缺点是操作过程长、繁杂、制备成本高。我们在本研究中，先考察了3种提取法对光果甘草中光甘草定的提取效率，并通过综合考虑最终提取效果、环保和成本等因素，筛选和建议提取效率较高和环保安全的乙醇提取方法；第二步，通过硅胶柱层析法对粗提物中不同极性的组分进行分组后，再利用制备型TLC方法分离和溶剂重结晶法纯化获得光甘草定纯品，简化了操作流程。本方法在快速制备高纯度的少量光甘草定产品中具有重要意义。
光甘草定在自由基引导的氧化系统中显示出很强的抗氧化活性，可防治与自由基氧化有关的某些病理变化，如动脉粥样硬化，细胞衰老等。此外，光甘草定尚有一定的降血脂和降血压的作用，在动脉硬化和心血管病的防治中显示出良好的药用开发前景。
我国西北地区甘草资源很丰富，甘草储备量比较大。目前甘草的药用主要针对其水溶性成分，而对脂溶性黄酮类成分的利用很少。光果甘草在西北地区（主要在新疆）分布比较广，储备量比较大，有野生和人工栽培资源。本研究工作在今后西北光果甘草资源的深入开发研究中将具有一定的参考价值。
参考文献：
［1］ Kuntz S，Wenzel U，Daniel H.Comparative analysis of the effects of flavonoids on proliferation，cytotoxicity，and apoptosis in human colon cancer cell lines［J］.Eur J Nutr，1999，38 (3)：133-142.
［2］ Yu XQ，Xue CC，Zhou ZW et al. In vitro and in vivo neuroprotective effect and mechanisms of glabridin，a major active isoflavan from Glycyrrhiza glabra (licorice)［J］.Life Sci.2008，82：68-78.
［3］ Vaya J，Belinky PA，Aviram M. Antioxidant constituents from licorice roots：isolation，structure elucidation and antioxidative capacity toward LDL oxidation［J］. Free Radic Biol Med，1997，23 (2)：302-313.
［4］ Fuhrman B，Volkova N，Kaplan M，Presser D，Attias J，Hayek T，Aviram M. Antiatherosclerotic effects of licorice extract supplementation on hypercholesterolemic patients：increased resistance of LDL to atherogenic modifications，reduced plasma lipid levels，and decreased systolic blood pressure［J］. Nutrition. 2002，18 (3)：268-273.
［5］ Fuhrman B，Buch S，Vaya J，Belinky PA，Coleman R，Hayek T，Aviram M. Licorice extract and its major polyphenol glabridin protect low-density lipoprotein against lipid peroxidation：in vitro and ex vivo studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E-deficient mice［J］. Am J Clin Nutr.1997，66 (2)：267-275.
［6］ 木合布力・阿布力孜，热娜・卡斯木，马淑燕，等.甘草中光甘草定的提取方法和抗氧化活性研究［J］.天然产物研究与开发，2007，19(4)：675-682.
［7］ 李佳，宋新波，余保林，等.高效液相色谱法测定光果甘草中光甘草定的含量［J］.天津中医药，2008，25（2）：157-158.
（责任编辑：王尚勇）
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