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【摘要】目的:建立反相高效液相色谱法测定养阴生肌散中龙胆苦苷的含量。方法:色谱柱:Aglient XDB-C18(250*4.6mm);流动相:水-乙腈(80:20);流速:1.0ml�min-1;检测波长:254nm。结果:龙胆苦苷在20～110ug�ml-1范围里线性关系良好,平均回收率为98.10%,符合分析要求。结论:所建方法操作简便、结果准确,重复性好,可用于该制剂的质量控制。
【关键词】高效液相色谱法;复方养阴生肌散;龙胆苦苷
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-017-2
复方养阴生肌散是由青黛、龙胆草、黄柏、薄荷、甘草等多味中药组成的复方制剂。由于成分复杂,各味药的含量均不是很高,有效成分浓度相对较低,传统的TLC法定量分析难以达到准确分析,误差太大,很难达到定量分析的目的,因此,有必要创建HPLC法测定其主要含量。龙胆草是处方主要组成部分,其指标成分龙胆苦苷(Gentiopicrin)不仅性质稳定且单味药的提取率高,因此建立复方养阴生肌散中龙胆苦苷的高效液相色谱法,可用于检测处方药的提取工艺,监控复方养阴生肌散的制剂质量。方法简便、迅速、准确,重现性好。
1仪器与试药
Aglient 1100高效液相色谱仪;Aglient紫外检测器;KQ2200型超声波清洗仪;TGL-16C型离心机;减压真空干燥器。
龙胆苦苷对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号:11070-200810);乙腈为色谱醇;水为重蒸水;所用其它试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:Aglient XDB-C18(250*4.6mm);流动相:水-乙腈(80:20);流速1.0ml�min-1;检测波长:254nm;进样量:10μl;柱温:25.0℃;外标法。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算不得低于3500。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液
取龙胆苦苷对照品置五氧化二磷减压干燥器中放置12小时以上,精密称定,用甲醇配制成浓度为0.8mg�ml-1的对照品溶液。
2.2.2供试品溶液
取本品约1.84g,精密称定,置50ml烧杯中,加甲醇适量,超声10min,放至室温,过滤到25ml的容量瓶中,再用甲醇稀释并定容至刻度,摇匀。再精密移取上述溶液8ml至25ml容量瓶,加甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,即为供试品溶液。
2.2.3阴性对照溶液
取除龙胆草外处方中其它药材,按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备,即得阴性对照品溶液。
2.3专属性实验
分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件操作,记录色谱图。结果供试品与对照品溶液均在相同保留时间出现吸收峰,空白溶液在此处无吸收峰,即本试验条件下龙胆苦苷与其它组分分离完全。结果见图1。
2.4线性关系考察
取龙胆苦苷对照品适量,精密称定,制备浓度为0.41mg�ml-1的对照品储备液,精密吸取对照品储备液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml分别置10ml容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,依次进样10μl,记录峰面积。以浓度-峰面积进行回归,所得线性方程为:y=12519x+23859,相关系数:r=0.9998(n=5),结果表明龙胆苦苷在20～110ug�ml-1范围内线性关系良好。
图1 养阴生肌散龙胆苦苷专属性考察
A-阴性溶液;B-供试品溶液;C-龙胆苦苷对照品溶液
2.5精密度试验
精密吸取同一浓度龙胆苦苷对照品溶液(82ug�ml-1),重复进样7次,进样量10μl,以龙胆苦苷峰面积计算,RSD为0.89%(n=7)。结果表明,精密度较好。
2.6重复性试验
分别取同批样品粉末6份,精密称定。按“2.2”项下方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下条件进样分析。计算样品中龙胆苦苷含量,结果RSD为1.25%。结果表明,重复性较好。
2.7加样回收试验
采用加样回收法,取样品适量,精密称定,分别精密加入已知含量的低、中、高浓度的龙胆苦苷对照品,按“2.1”“2.2”项方法操作,计算回收率。结果见表1。
表1 回收率测定结果
测得量 (ug) 加入量标准品(ug) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%)
77.01 78.68 97.88 98.10 0.41
76.37 78.68 97.06
77.3 78.68 98.25
102.92 104.91 98.11
103.08 104.91 98.26
102.55 104.91 97.75
118.86 120.65 98.52
119.07 120.65 98.69
118.68 120.65 98.37
2.8样品测定
取三批样品。按“2.2”项方法制样,按“2.1”项条件操作,计算三批样品中龙胆苦苷的平均含量为0.63%,RSD=1.58%。
3讨论
3.1检测波长的选取龙胆苦苷的最大吸收波长在274nm处,当采用274nm为检测波长时,检测灵敏度较高,但相应杂峰增多,基线不平稳,分离度较差,当采用254nm为检测波长时,基线平稳,分离度好。此外在254nm处同一流动相下还可以检测到处方中另外一味药的有效成分,而且两中成分的呈基线分离。因此,选取254nm作为检测波长。
3.2含量测定时对提取溶剂和提取方法做了正交试验考察,结果甲醇超声提取时干扰最少,含量最高。对不同的流动相及同种流动相的不同比例进行考察,结果流动相为乙腈-水(20-80)时,峰高、分离度和理论塔板数都比较好且基线平稳。此外,用乙腈-水(20-80)作流动相还可以在同一检测波长下分离复方中药中的另外一味有效成分。
参考文献
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