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麻疹是儿童常见的一种急性传染病,其传染性很强,以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。我国自20世纪60年代初应用减毒活疫苗以来,发病率显著下降。但每年在全球仍有散发患者,并在一定范围内造成流行,引起死亡。麻疹病毒只有一种血清型,但近年对其基因的分析发现,麻疹病毒有8个基因组,23个基因型。在不同地区和时间流行株的基因型不同,通过对麻疹病毒基因型可以进行病原学分析,判断传染源和传播途径。
1 材料与方法
1.1 标本来源 采集2007~2008年吉林市疑似麻疹患者出疹1~5 d内咽拭12份和尿液6份,同时采集咽拭和尿液5份。咽拭采集后置于2~3 ml含2%小牛血清、终浓度为1 000 U/ml的青霉素和链霉素、50U/ml制霉菌素的DMEM中标本运输液中,尿标本采集10~50 ml,-20℃冻存。
1.2 总RNA提取及H、M基因的RT-PCR 总RNA提取采用Trizol(Invitrogen,US)法。根据美国疾病预防控制中心数据[1]和文献[2]设计N和M基因引物如下。麻疹病毒核蛋白(N)基因引物:上游序列5’-ACTACAATCAGAGGTCAATTC-3’,下游序列5’-AGCATGTCTCCATTCGCAACT-3’,用于扩增N基因羧基末端的571bp的片段。麻疹病毒基质蛋白(M)基因引物:上游序列5’-ACGCGTCGACAAAAAACTTA-3’,下游序列5’-ATCCGGGTCGTTTTCGGGCA-3’,用于扩增M基因中的188bp片段。RT-PCR 使用大连宝生物TaKaRa RNA PCR kit(AMV)试剂盒,严格按照试剂盒说明取1μl麻疹病毒的RNA提取物作为模板合成cDNA,再PCR扩增所需的两个(N和M)目的片段。每次同时取北京天坛生物制品股份有限公司生产的冻干麻疹活疫苗株长春-47(批号:2005081101)做阳性对照,取双蒸水做阴性对照。
1.3 核酸序列的电泳、回收纯化和鉴定 将N、M基因片段PCR扩增产物,经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。PCR的产物在紫外灯下切割,经天为时代凝胶回收试剂盒回收和纯化,送上海生工生物技术公司测序。
1.4 核酸序列分析 采用SeqEd.V 1.0.3程序对核酸序列相应的氨基酸序列及基因差异进行计算机分析。采用DNA STAR 软件MegAlign 程序,对N和M基因片段的核酸序列做序列系统树分析。
2 结果
2.1 麻疹病毒分离及鉴定结果 本次从尿液标本中分离到3株麻疹病毒,分离阳性率为 16.67%;从咽拭标本中分离到4株麻疹病毒,分离阳性率为 22.22%。尿液标本分离率低于咽拭标本,但二者没有统计学意义。见图1、2。
2.2 RT-PCR结果,疫苗株和患者标本均扩增得到约N基因600 bp、M基因200 bp核酸片段。阴性对照则无此片段。
2.3 对7个标本的N基因450 bp的核酸序列与GenBank中的22个基因亚型做序列系统树。2007年3个流行株之间同源性为99.8%,2008年4个流行株之间同源性为100%,即核酸序列完全相同,属同一流行株,但不同于疫苗株长春-47。两年之间流行株的差异率为0.4%。与世界其他22个麻疹病毒代表株的差异率为6.6%~10.9%。
2.4 测定M基因的144 bp中,流行株均有4~11 bp不同于疫苗株CHANGCHUN-47,其中JL06-1株突变有意义,其有义突变有2处,3 647 bp 处G→T,引起氨基酸改变V→G;3 680 bp 处T→G,引起氨基酸改变Q→E。与GeneBank中能引起亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panencephalitis,SSPE)代表之间的关系。
图1 Vero/SLAM细胞
图2 麻疹野毒株在Vero/SLAM细胞上的病变
3 讨论
麻疹是一种传播迅速、波及广泛的传染病。尽管麻疹病毒被认为是单一血清型别,但是序列分析表明,存在着截然不同的麻疹野病毒基因型并共同在人类中传播。从本次麻疹病毒基因序列的分析中可以看出,吉林市2007年分离得到的3株同源性99.8%,2008年分离得到的4株同源性100%。说明每年的流行均为同一传染源引起,本流行期内的麻疹病毒几乎是同源的,在持续的人与人传播的过程中几乎不发生基因变异。
对麻疹病毒的全基因组序列研究表明,本次分离麻疹病毒流行株N基因1 408处G→A,引起氨基酸改变G→S;1 421处G→A,引起氨基酸改变A→D。这些氨基酸的变异可能直接影响到蛋白质的高级结构,从而可能引起抗原性变异,对病毒的抗原性影响程度尚需进一步研究。本次对M基因相对易变序列的研究结果与国外报道相符合[3]。
虽然麻疹病毒基因分型没有固定模式,但M、N基因分型基本一致[4],分型均属于H1基因型。根据序列分析和基因分型,虽然不能完全确定麻疹病毒株的地理起源,但可以更加准确直观的确认不同流行期、不同地域的麻疹病毒株之间的关系,确定现流行的优势毒株,为麻疹病毒流行株的监测和麻疹控制策略提供强有力的支持。
参 考 文 献
[1] Minimum N gene sequence(450 nucleotides)required for genotyping(sequence from Edmonston wildtype virus; codon start=1).http://www.cdc.gov.
[2] WHO.Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses(Update).WER,2001,76:241-247.
[3] Patterson JB,Cornu TI,Redwine J,et al.Evidence that the hypermutated M protein of a subacute sclerosing panencephalitis measles virus actively contributes to the chronic progressive CNS disease.Virology,2001,291(2):215-25.
[4] Michaela AR,Jennifer SR,Paul AR,et al.Review of the temporal and geographical distribution of measles virus genotypes in the prevaccine and postvaccine eras.Virol J,2005,2:87.
