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[摘要] 目的:探讨使用MB-80微生物动态检测系统应用动态浊度法进行原辅材料内毒素检测的方法与可行性。方法:摸索建立动态浊度法检测各种原辅材料内毒素的方法,将122份样本使用MB-80微生物动态检测系统应用动态浊度法检测,同时进行凝胶法实验,比较结果。结果:动态浊度法和凝胶法检测结果一致。结论:使用MB-80微生物动态检测系统应用动态浊度法检测血站原辅材料内毒素的方法是可行的。
[关键词] 凝胶法;动态浊度法;原辅材料;MB-80微生物动态检测系统
[中图分类号] R37 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2010)03(a)-130-02
《中国输血技术操作规程》1997版中规定血站使用的一次性血袋和一次性注射器必须进行热原检测,检查方法使用细菌内毒素检查法[1]。为保证血液质量,本站将制备血液的各种原辅材料也参照上述检测项目进行实验。以往本站使用凝胶法对原辅材料内毒素进行检测,只能判定是否合格,而无法检测出准确的内毒素含量。为提高血站原辅材料质量控制水平,本站引进了MB-80微生物动态检测系统进行细菌内毒素定量检测,通过实验与摸索,建立了各种原辅材料内毒素的检测方法。通过对122份各种原辅材料样本使用动态浊度法和凝胶法进行内毒素实验,检测结果一致。现将实验方法报道如下:
1 资料与方法
1.1 一般资料
2009年1～12月抽检的共122份各种原辅材料样本(包括血袋、滤器、注射器、复方甘油、浓氯化钠、氯化钠、各种空腔耗材等)。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器动态浊度法:MB-80微生物动态检测系统(北京金山川科技发展有限公司);凝胶法:TAL-40A试管恒温仪。
1.2.2 试剂动态浊度法:细菌内毒素工作标准品(10 EU/支,批号:070618);革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒(灵敏度:0.01 EU/ml,批号:EKT105);以上试剂均由北京金山川科技发展有限公司提供。凝胶法:细菌内毒素工作标准品(10 EU/支,批号:0703260);鲎试剂(灵敏度:0.25 EU/ml、0.06 EU/ml,批号:0705181、0703161);以上试剂均由湛江安度斯生物有限公司提供。所有试剂均在有效期内。
1.3 实验方法
1.3.1 供试品处理将血袋在百级净化台内将血液保存液释放入空袋内,再与红细胞保存液混合,在密闭系统内反复混匀,置于37℃恒温箱浸提1 h,取混合保存液作为供试品检测。其余装有液体的样本,直接抽取袋内溶液作为供试品检测。空腔耗材根据产品标准规定的内毒素限值确定授提介质体积,用内毒素检查用水浸泡器具内腔,置37℃恒温箱浸提1 h制备供试液。
1.3.2 标准曲线的可靠性试验用标准内毒素配成2、0.25、0.031 25 EU/ml 3个浓度作标准曲线。每一浓度做3支平行管,同时做2支阴性对照。检测结果,阴性对照反应时间均>3 600 s,大于标准曲线最低浓度的反应时间,r=-0.992 24,实验有效。
1.3.3 确定最大有效稀释倍数(MVD)MVD=CL/λ;其中C是供试品浓度为1.0 ml/ml;L是原辅材料内毒素限值;λ是标准曲线上最低的内毒素浓度为0.031 25 EU/ml。
1.3.4 干扰实验选择0.5 EU/ml作为原辅材料干扰试验中添加的内毒素浓度。选择原液及各稀释倍数的供试品作为实验溶液,稀释剂使用革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒中提供的样品处理液,按照中国药典2005年版细菌内毒素检查法操作[2]。实验结果回收率在50%～200%之间的,不存在干扰作用。依此实验确定原辅材料细菌内毒素定量检测的稀释倍数。
1.3.5 本法与凝胶法的对照实验将122份原辅材料样本先按照相应方法进行处理并按照干扰实验确定的稀释倍数稀释后,按照干扰实验的操作步骤进行操作,使用MB-80微生物动态检测系统进行检测,同时用凝胶法做对照实验。
2 结果
见表1。
实验结果,使用动态浊度法和凝胶法对122份原辅材料样本同时进行细菌内毒素检测,结果完全一致。
3 讨论
依据干扰实验结果,确定样品稀释倍数。样品的内毒素回收率在50%～200%范围内,表明在该实验条件下,所稀释的样品浓度已对动态浊度法内毒素定量测定无干扰。该检测浓度可以作为日常检查的样品浓度。
原辅材料使用凝胶法检测,很容易出现假阳性或假阴性的结果,使用MB-80微生物动态检测系统进行检测,使用计算机监控,样品的反应情况在电脑上能够直观地反映出来。而且抗干扰能力较凝胶法强。
以往使用的凝胶法因为是手工检测、肉眼观察,所以无原始记录保留,而使用MB-80微生物动态检测系统因是定量检测而且使用计算机判读,能够清楚地保留实验的原始记录,这对于血站一旦发生输血纠纷时的举证非常关键。
使用MB-80微生物动态检测系统进行原辅材料内毒素检测,操作较凝胶法更简单,且能更直观地观察样品的变化情况,尤其是临界值的样本,对于原辅材料的质量控制具有非常重要的意义,且对于选择供应商具有重要的参考价值[3]。
MB-80微生物动态检测系统不但能够进行原辅材料的细菌内毒素检测,还能进行血液内毒素、血液真菌的检测,对于血站的血液质量控制具有意义重大[4]。
内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原,控制内毒素污染就等于控制热原污染,为保证血液安全,严格控制每一批原辅材料的内毒素是十分必要的[5],使用MB-80微生物动态检测系统进行原辅材料的内毒素检测,方便、快速、灵敏,且与凝胶法结果完全一致。因此,应用MB-80微生物动态检测系统使用动态浊度法定量检测原辅材料细菌内毒素含量的方法是可行的,且较凝胶法具有更重要的意义。
[参考文献]
[1]中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程血站部分[M].天津:科学技术出版社,1997:49.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2部.北京:化学工业出版社,2000:附录88.
[3]刘芳,董小平,许淑春,等.LKM-32-02细菌内毒素检测系统在血站使用初探[J].基层医学论坛,2009,13(4):344-345.
[4]李冰,李俊杰,张振宇,等.血站一次性无菌采血器材的检测[J].中国误诊学杂志,2008,6(7):2524-2525.
[5]陈宇,许岚.血液保养液的细菌内毒素检测[J].中国输血杂志,2008,8(19):309-310.
(收稿日期:2010-01-28)
