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[摘要] 随着超声微泡造影剂研制的进展和临床应用,超声微泡不仅应用于超声显像,还可用于促进生物活性物质进入组织,实现药物或治疗性基因的定向释放,从而增强靶器官治疗效果,是一种高效、安全、无创、易于操作的治疗手段。作者简要综述超声微泡传输物质的机制及其在心血管疾病治疗应用中的研究进展。
［关键词］ 超声; 微泡造影剂; 心血管疾病; 治疗； 综述
［中图分类号］ R459.6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1671-7256(2011)02-0248-04
doi：10.3969/j.issn.1671-7256.2011．02.044
超声波是一种机械波,其频率通常高于人耳听觉的上限(20 kHz)。自P.Langevin在1916年研究水下超声波开始,超声的应用渗透到众多领域。1972年灰阶超声问世,超声在医学领域广泛应用。超声微泡是医学超声的又一进展,目前主要应用于超声显像诊断。微泡在超声显像诊断方面,主要是利用声波对气体反射比液体大,改变声波与组织间的吸收、反射和折射等相互作用,使超声回声增强,得到更高的对比分辨力。而在超声微泡能辅助基因、药物传输这一观点提出后,超声微泡作为运送生物活性物质载体的研究,使得超声微泡在治疗领域的研究吸引了很多的关注。我们对近年来超声介导微泡技术在心血管疾病靶向治疗中的应用及相关研究作一综述,重点介绍超声微泡传输物质的物化机制,以及其在心血管疾病治疗中的研究进展。
1 超声微泡生物活性物质的递送
1.1 超声微泡
超声微泡造影剂是由生物相容性材料制成的外壳和核心气体填充后组成［1］。外壳主要由蛋白质、脂类或者生物聚合物组成,外壳厚度从10 nm至200 nm不等,而高分子量和低水溶性的填充气体(氟碳或六氟化硫)构成了造影剂的核心部分。目前多数研究选用含有全氟显气体的白蛋白或脂质外壳的微泡。这类微泡具有易碎(中等强度声强下即破裂)和易制作优点。
自Gramiak等［2］于1968年报道了第一例超声造影剂注射后增加心室动脉的超声波信号后,超声造影剂开始应用于临床。至今，超声微泡造影剂的发展分成3个阶段［1］：第一阶段造影剂代表类型为Echovist,多为空气或者氧气,无膜包被,尺寸大,由于其不稳定性,在血液中持续时间较短,无法通过肺循环,因而只能对右心显影,应用受到了很大限制。第二阶段超声造影剂代表类型为Albunex和Levovist。其填充气体为空气,包被白蛋白、脂类、聚合物或活性剂作为外壳,稳定性好,尺寸小,自此超声造影剂开始向微泡级别发展。第三阶段造影剂代表类型为Optison和SonoVue,造影剂内含氟碳类气体,有膜包被,稳定性较前显著提高。
1.2 超声微泡物质递送
微泡的生物学特性使其成为将基因或药物等递送到靶细胞或组织中的理想手段。微泡承载生物活性物质主要通过以下方式:（1) 药物附着在微泡表面；（2) 药物镶嵌在微泡外壳内；（3) DNA非共价结合到微泡表面；（4) 微泡内部装载药物、气体等；（5) 疏水性物质纳入油性材料层包绕在微泡核心和外壳之间。将载有目的基因或者药物的超声微泡经静脉注射后,在靶细胞或组织给予一定条件的超声照射,可明显提高体内细胞、局部组织的基因转染率或药物浓度［3-4］。
超声单独作用已经证实有提高DNA摄取,药物、蛋白组织运送作用,其重要机制之一为超声空化效应［5］。超声空化是强超声在液体中引起的一种特有的物理现象。人工注入的超声微泡可被看作是人造的空化核,用以增加血液中空化核的浓度,从而降低空化阈值,低剂量超声即可产生空化效应［6］。微泡在靶向区域破裂,提高了目标部位的药物浓度,同时空化效应使细胞膜表面形成许多大小不等、数量不一的小孔(声孔效应),细胞膜的通透性增加,使得大分子物质更容易进入细胞或组织内。
2 超声微泡在心血管疾病治疗中的应用
超声微泡造影剂在心血管疾病中治疗中的应用主要包括以下几个方面：
2.1 介导基因转染
超声微泡的一些特性正满足基因治疗载体所需的特点,如低毒性、低免疫原性、低创伤、可重复性、靶向性。国内外学者研究发现，超声微泡造影剂可作为一种新型的体内基因转染载体。首例超声微泡心脏基因治疗是将表达β-糖苷酶的腺病毒重组体连接到白蛋白微泡,由静脉注射的同时对心脏进行超声波干预,实验证实实验组鼠心脏β-糖苷酶表达量较对照组提高10倍。腺病毒载体存在器官特异性低,免疫原性大等缺陷,限制了其反复应用，后来使用超声微泡传递裸DNA质粒至兔心脏以克服腺病毒载体的主要缺陷。相对于腺病毒载体,超声微泡传递裸DNA可以达到100%的器官特异性,因为DNA进入循环后可迅速被血浆中的DNA酶降解,所以不会转染到其他组织。DNA即时表达曲线显示，超声微泡作用后4 d表达最高,之后又迅速下降。短周期反复治疗可以延长高水平荧光酶表达［7］。重复治疗使基因持续表达成为可能。其他心脏基因转染研究包括在兔子心脏中转染TNF-α反义核苷酸减少缺血后TNF-α的产生［8］,也有人在狗等大型动物身上开始类似研究［9］。但是,心血管领域基因治疗技术仍然处于探索阶段,目前仍未进入临床研究。
尽管体外实验证实,超声微泡介导的基因转染的确有效增加基因转染率,但是当前的主要缺陷是转染率过低。多数研究都是拿超声微泡介导的基因表达与单独裸DNA比较。在一些研究中,的确超声微泡介导要比单独裸DNA注射高出许多,可能可以满足临床要求。然而，器官中有多少细胞被转染？是否会产生有益的生理效应如血管增生,心衰改善或者缺陷基因纠正？是否可以在大型动物中达到类似效果？对于上述问题研究正在不断探索。
2.2 促进小血管新生
很多实验研究均提示，超声微泡能刺激血管新生,从而可能改善缺血性心脏病预后。血管生长因子包括内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(BFGF)和肝细胞生长因子(HGF)等。其中VEGF是上调血管形成的重要因子,也是不可缺少的诱导因子。它能特异地直接作用于血管内皮细胞,诱导其增殖、迁徙,诱导血管腔形成。超声微泡可通过下列途径增加靶器官VEGF表达：（1） 超声破坏微泡产生的空化效应能引起直径≤�7 μm的微血管破裂,这对机体是一种无菌性炎症刺激,可诱导局部产生炎症反应,炎症细胞在局部浸润并释放血管生长因子(主要是VEGF),从而促进小血管新生。（2） 将微泡表面黏附外源性VEGF基因,通过超声波的作用使VEGF基因完成从微泡的表面到细胞和组织的传递,促血管新生。
Yoshida等［10］实验证明,超声破坏微泡所引起的空化效应可促使内源性VEGF分泌增加,促进大鼠缺血肢体血管新生,改善运动功能。李雪霖等［11］也发现超声破坏微泡心肌组织大量红细胞漏出,炎症细胞浸润,心肌组织中可见大量VEGF表达。同时可在微泡表面黏附外源性VEGF基因,通过超声波的作用使VEGF基因完成从微泡的表面到细胞和组织的传递,促血管新生。也有研究将VEGF基因黏附于全氟显微泡外壳后输入心肌梗死模型鼠体内,联合超声波照射,结果也发现超声+微泡+VEGF组心肌组织VEGF表达高,并且可见大量新生血管。
2.3 溶栓作用
研究［12］证实，在理想的条件下微泡与超声合用可以完美地溶解血栓,并且不会引起出血等并发症。一方面超声波可以直接作用于血栓,在纵向和横向两个方面相对于血栓产生强烈的振动作用,使血栓发生松解和表面损坏。超声波产生的空化现象可使血栓在极短的时间内碎解成细小的颗粒,有试验证明,在体内超声波能使D-二聚体增加,从而增强纤维蛋白溶解作用。另一方面注入超声微泡后增强了超声波的空化效应。微泡在超声波作用下发生周期性膨胀和萎陷,在膨胀达到极限时崩溃,产生强大的剪切应力和由微泡碎片及液体组成的射流,两者共同作用于血栓,使血栓表面撕裂,内部裂隙增多。这些撕裂和裂隙的存在为更多微泡进入血栓内部提供了通道,使更多微泡渗入血栓,在超声作用下再一次发生空化效应,从而发挥更大的溶栓作用。超声波的声空化作用对于纤维斑块有很高的选择性破坏作用,从而可以避免损伤血管管壁,并可用于消融陈旧性的血栓斑块,这种超声空化的生物选择性是超声波治疗安全性的保证［13-14］。
目前国外已有许多学者进行超声联合微泡的溶栓研究。Poter等［15］利用超声微泡作用于体内外血栓体外实验中,血栓均能溶解,但是体内实验中使用1 MHz超声联合微泡后血管再通率仅为28.57%。Cintas等［16］利用2 MHz超声联合微泡进行的溶栓实验也取得了良好的效果。国内徐亚丽等［17］超声微泡治疗股动脉血栓实验结果显示,超声微泡血管再通率达到87.5%。这些结果令人鼓舞。但是，超声微泡的这些应用都需要比诊断用超声和传送物质超声能量高的多。这些应用所致组织破坏尚需评价。
2.4 促进心肌内干细胞靶向归巢
干细胞移植治疗急性心肌梗死是近年国内外研究的热点，但干细胞靶向归巢率低成为干细胞移植治疗心梗的难题之一。近年大量的研究发现,超声微泡可显著促进心肌内干细胞靶向归巢。国外研究［18］发现，在输入微泡并超声辐照后有利于内皮祖细胞的增殖,从而促进心功能的恢复。徐琢等［19-20］研究证明，超声联合微泡可增效骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗猪急性心肌梗死,能更有效地改善心肌梗死后的心功能,促进血管新生。超声微泡增效干细胞移植效率的具体分子生物学机制尚不完全明确,有些文献指出超声微泡的这种作用可能与空化效应致血管壁通透性增加、局部血管内皮黏附因子等表达上调有关。
3 存在问题和展望
近十几年来,超声微泡应用于心血管疾病治疗的研究取得了一定进展,但随着研究的逐渐深入,仍有一些问题有待解决。首先,超声微泡空化作用在促进物质进入组织和细胞的同时,也存在导致细胞和组织的破坏的危险。最常见的副作用是毛细血管破裂、出血、染色物外溢。同时这些体外研究弹丸注射微泡剂量比临床使用量高出许多。说明这项技术与局部微泡浓度、超声作用时间、声压密切相关。因此，需优化诸因素以使副作用减到最小同时发挥最大治疗效应。其次，超声波是否会造成治疗所需的药物、基因、细胞等生物活性变化,同时还需要在大型动物上进行进一步研究。
超声微泡在心血管疾病治疗领域仍有很大潜力,随着分子生物学和超声技术在医学领域的发展以及微泡造影剂的研制进展,构建更能有效促进基因转染或干细胞移植的微泡应用于临床治疗终将成为可能。
［参考文献］
［1］ QUAIA E.Microbubble ultrasound contrast agents: an update［J］. Eur Radiol, 2007,17(8):1995-2008.
［2］ GRAMIAK R, SHAH P M. Echocardiography of the aortic root［J］. Invest Radiol, 1968,3(5):356-366.
［3］ DELALANDE A, BUREAU M F, MIDOUX P, et al. Ultrasound-assisted microbubbles gene transfer in tendons for gene therapy［J］. Ultrasonics, 2010, 50(2): 269-272.
［4］ KLIBANOV A L, SHEVCHENKO T I, RAJU B I, et al. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery［J］. J Control Release, 2010,148(1):13-17.
［5］ DUCK F A. Hazards,risks and safety of diagnostic ultrasound［J］. Med Eng Phys, 2008, 30(10): 1338-1348.
［6］ 顾映洁,孙丽洲,蒋小青,等.超声辐射微泡剂对家兔卵巢血管的影响［J］.现代医学,2007,35(4):257-260.
［7］ BEKEREDJIAN R, CHEN S, FRENKEL P A, et al. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart［J］. Circulation, 2003,108(8):1022-1026.
［8］ ERIKSON J M, FREEMAN G L, CHANDRASEKAR B. Ultrasound-targeted antisense oligonucleotide attenuates ischemia/reperfusion-induced myocardial tumor necrosis factor-alpha［J］. J Mol Cell Cardiol, 2003,35(1):119-130.
［9］ VANNAN M, McCREERY T, LI P, et al. Ultrasound-mediated transfection of canine myocardium by intravenous administration of cationic microbubble-linked plasmid DNA［J］. J Am Soc Echocardiogr, 2002,15(3):214-218．
［10］ YOSHIDA J, OHMORI K, TAKEUCHI H, et al. Treatment of ischemic limbs based on local recruit［J］. J Am Coll Cardiol, 2005,46(5):899-905.
［11］ 李雪霖,王志刚,凌智瑜.超声破坏微泡造影剂促进大鼠心肌血管新生的实验研究［J］.中国超声医学杂志,2007, 23(1):6-8.
［12］ UNGER E C, PORTER T, CULP W, et al. Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles［J］. Adv Drug Deliv Rev,2004,56(9): 1291-1314．
［13］ ALONSO A, DEMPFLE C E, DELLA-MARTINA A, et al. In vivo clot lysis of human thrombus with intravenous abciximab immunobubbles and Ultrasound［J］. Thromb Res, 2009,124(1):70-74.
［14］ XIE F,LOF J,MATSUNAGA T, et al. Diagnostic ultrasound combined with glycoprotein IIb/IIIa-targeted microbubbles improves microvascular recovery after acute coronary thrombotic occlusions［J］. Circulation, 2009,119(10):1378-1385.
［15］ PORTER T R, KRICSFELD D, LOF J, et al. Effectiveness of transcranial and transthoracic ultrasound and microbubbles in dissolving intravascular thrombi［J］. J Ultrasound Med, 2001,20(12):1313-1325.
［16］ CINTAS P, NGUYEN F, BONEU B, et al. Enhancement of enzymatic fibrinolysis with 2-MHz ultrasound and microbubbles［J］.J Thromb Haemost,2004,2(7):1163-1166.
［17］ 徐亚丽, 高云华, 刘政,等.微泡增强超声助溶兔股动脉血栓的实验研究［J］.中国超声医学杂志,2006,22(6):404-406.
［18］ ZEN K, OKIGAKI M, HOSOKAWA Y, et al. Myocardium-targeted delivery of endothelial progenitor cells by ultrasound-mediated microbubble destructi on improves cardiac function via an angiogenic response［J］. J Mol Cell Cardiol, 2006,(40):799-809.
［19］ 徐琢,冯毅,童嘉毅,等.超声微泡辅助干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究［J］.东南大学学报:医学版,2008,27(3):192-194.
［20］ 李金鹆,徐琢,马根山,等.超声微泡增效骨髓干细胞移植效率的实验研究［J］.中国实用医药,2007,2(33):425-427.
