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[作者简介]吴邦富，男，43岁，医学硕士，副主任医师，副教授，现在华中科技大学同济医学院附属东莞医院。发表论文20余篇。 [摘要]目的：观察HBsAg致敏患者自体外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)疫苗(简称抗HBV-DC)治疗慢性乙型肝炎(CHB)的临床效果。方法：11例HBeAg阳性CHB和5例HBeAg阴性CHB患者接受临床试验。取外周静脉血25 ml，用密度梯度离心及贴壁法获得单核细胞，以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增出DC，第5天给予30 μg的HBsAg致敏DC。第7天收获DC静脉回输，每周1次，共4次。治疗前后检测HBV标志物定量、HBV-DNA定量及肝功能。结果：好转15例，治愈1例，有效率为100%，治愈率6.25%。治疗前后HBsAg为(195.85±109.18) ng/ml和(69.98±78.65) ng/ml(t＝5.14，P
树突状细胞(DC)的功能低下是人感染乙型肝炎病毒(HBV)后机体免疫系统对HBV发生免疫耐受并最终使感染慢性化的主要原因[1-7]。目前尚无有效的药物能够彻底治愈慢性乙型肝炎(CHB)的患者，期望依靠药物治疗达到清除病毒而彻底治愈CHB患者几乎不可能。所以，目前CHB治疗的总体目标只能要求最大限度地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展[8]。重新启动机体免疫系统对HBV的免疫反应，才有可能彻底治愈CHB患者。我们以CHB患者自体外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC治疗CHB患者，初步的临床试验取得了良好的治疗效果，现报道如下：
1材料与方法
1.1病例选择
2005年4月～2006年4月，16例轻度CHB患者接受了临床试验，男14例，女2例，年龄32±13岁。均符合2000年西安会议制定的《病毒性肝炎防治方案》[9]及2005年我国首部《慢性乙型肝炎防治指南》[8]的标准。其中HBeAg阳性CHB患者11例，HBeAg阴性CHB患者5例。所有患者近1年内未接受过抗HBV药物、免疫调节剂及护肝药物的治疗，临床试验期间也不使用抗HBV药物、免疫调节剂及护肝药物。
试验符合广州医学院附属市十二人民医院人体临床试验伦理学标准，并得到医院伦理委员会的批准。试验开始前所有受试者均签署了知情同意书。
1.2方法
取患者肝素抗凝的外周静脉血25 ml，以密度梯度离心及贴壁法获得单个核细胞。DC的诱导培养方法参照文献并作适当修改[1，10]：在37℃和5%CO2浓度的条件下，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）等细胞因子诱导扩增出DC，于培养第5天给予30 μg的HBsAg致敏该DC，使其成为具有特异性治疗慢性乙型肝炎的DC疫苗，简称抗HBV-DC。
培养第7天收获DC，并以生理盐水洗涤2次，获得5.0×105～1.0×106的抗HBV-DC，加入100 ml生理盐水中，以输血器静脉回输，每周1次，每例患者接受4次治疗。
1.3标本检测
第1次回输治疗前及第4次回输治疗后7～10 d分别留取患者静脉血标本。以时间分辨荧光法检测患者血清HBV标志物定量，以荧光定量PCR检测血清HBV-DNA定量。同时检测患者的肝功能，包括ALT及TBIL。
1.4疗效判定标准
治愈：治疗后HBsAg、HBeAg及HBV-DNA三项均在正常值范围内，并且肝功能正常。好转：对于HBeAg阳性CHB患者，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA有两项或三项分别下降10%以上；对于HBeAg阴性CHB患者，HBsAg及HBV-DNA有一项或两项分别下降10%以上。无效：达不到治愈和好转标准者。治愈及好转为有效。
1.5统计处理
以SPSS15.0进行统计学处理。数据以x±S表示，差异显著性检验采用配对样本的t检验，确定当P＜0.05时为差异有统计学意义。
2结果
2.1总体疗效
治愈1例，好转15例，总有效率为100%（16/16），治愈率6.25%（1/16）。
2.2治疗前后血清HBV标志物及HBV-DNA定量的变化
见表1。
CHB患者治疗前后的HBsAg分别为（195.85±109.18） ng/ml和（69.98±78.65）ng/ml，显著下降，有统计学意义（t＝5.14，P 目前用于治疗CHB患者的抗病毒药物主要包括核苷类似物和干扰素，这些抗病毒药物只能抑制HBV的复制，而不能清除肝细胞核内的共价闭合环状DNA(cccDNA)，停药后常常复发。要达到持久地抑制或彻底地清除HBV，有赖于机体免疫系统功能的恢复。因此，免疫调节剂常用于CHB患者的治疗，如胸腺肽和某些具有免疫调节作用的中药制剂，他们通过调节机体免疫细胞的功能，期望改善或恢复机体免疫系统对HBV的免疫反应，但真正能够调动起机体免疫系统针对HBV产生有效的免疫反应的机会是相当小的，所以临床效果并不理想。
随着现代免疫技术的发展，目前可以在体外细胞培养条件下，通过定向诱导扩增PBMC，获得大量携带HBV抗原信息并且功能正常的DC。将这些DC回输给慢性HBV感染者，可望直接打破机体免疫系统对HBV的免疫耐受状态，恢复机体有缺陷的免疫系统的功能，重新启动机体免疫系统的抗HBV免疫反应，达到彻底清除病毒的目标。所以，在理论上这种方法的治疗效果应该明显优于目前的药物治疗。这在体外试验及动物模型的试验中已得到证实[1-7]，人体临床研究也取得了令人鼓舞的治疗效果[10-12]。我们的初步临床试验也表明，体外诱导扩增自身PBMC来源的DC，并经HBsAg致敏后的抗HBV-DC静脉回输，可有效地打破CHB患者免疫系统对HBV产生的免疫耐受状态，有效地抑制CHB患者的HBV-DNA复制，显著降低病毒抗原，促进HBeAb的产生，部分患者的病毒抗原得到彻底的清除。患者对这种治疗的耐受性良好，未见严重的不良反应出现，是一种安全、有效的治疗CHB患者的方法，显示出良好的应用前景。
在我们初步的临床试验中，抗HBV-DC回输治疗的次数还相当有限，也未联合使用抗病毒药物。可以预见的是：随着抗HBV-DC回输治疗次数的增加及疗程的延长，治愈率有望进一步提高；预先进行抗病毒治疗，在充分抑制病毒的复制后再接受本治疗，也可能进一步提高治愈率。
[参考文献]
[1]Shimizu Y, Guidotti LG, Fowler P, et al. Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis B virus transgenic mice[J].J Immunol, 1998, 161(9): 4520-4529.
[2]Beckebaum S, Cicinnati VR, Zhang X, et al. Hepatitis B virus-induced defect of monocyte-derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response in vitro: mechanisms for viral immune escape[J].Immunology, 2003, 109(4): 487-495.
[3]Zheng BJ, Zhou J, Qu D, et al. Selective functional deficit in dendritic cell--T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection[J]. J Viral Hepat, 2004, 11(3): 217-224.
[4]van der Molen RG, Sprengers D, Binda RS, et al. Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendritic cells of patients with chronic hepatitis B[J]. Hepatology, 2004, 40(3): 738-746.
[5]Furukawa S, Akbar SM, Hasebe A, et al. Production of hepatitis B surface antigen-pulsed dendritic cells from immunosuppressed murine hepatitis B virus carrier: evaluation of immunogenicity of antigen-pulsed dendritic cells in vivo[J]. Immunobiology, 2004, 209(7): 551-557.
[6]Akbar SM, Furukawa S, Hasebe A, et al. Production and efficacy of a dendritic cell-based therapeutic vaccine for murine chronic hepatitis B virus carrierer[J]. Int J Mol Med, 2004, 14(2): 295-299.
[7]Akbar SM, Horiike N, Onji M.Immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol, 2006, 12(18): 2876-2883.
[8]中华医学会肝病学分会、感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志，2005，13(12)：881-891.
[9]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000，8(6)：324-329.
[10]吴邦富，杨江英，周�，等. 抗HBV-DC治疗e抗原阳性慢性HBV感染者的初步临床研究[J].中国现代医生，2007，45(15)：1-2,9.
[11]Chen M, Li YG, Zhang DZ, et al.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: a clinical study[J].World J Gastroenterol, 2005, 11(12): 1806-1808.
[12]娄海山，白经修，司方明，等. 树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床观察[J].中华传染病杂志，2005，23(3)：203-204.
(收稿日期：2008-10-16)
