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[摘要] 目的：检测独一味的ITS基因序列片段，并利用ITS序列作为遗传标记分析了来自4个不同地区(甘南玛曲、西藏林芝、四川若尔盖道班、四川若尔盖热当坝)的独一味的遗传变异情况。方法：采用Plant DNA Mini Kit法作为基因组DNA提取的最佳方法，提取植物独一味的核基因组DNA，并且建立了适合独一味的PCR反应体系，利用合成的特异性PCR引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区序列进行套式扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到电泳图谱，并进行分析，测序。经Clusta 1X软件排序，MEGA3软件统计分析和分支分析，建立系统发育树，并计算各类群间的遗传距离。结果：琼脂糖电泳图谱及所测序列显示，来自于植物独一味的核DNA中rRNA基因内转录间隔区全长为670bp左右，甘南玛曲和西藏林芝的独一味遗传距离较小，四川与甘南玛曲和西藏林芝的独一味遗传距离较大。结论：基于ITS序列分析，作为品质突出的甘南玛曲独一味和其他地区的独一味相比，并未形成一个区别于其他地区独一味的一个独特的种。根据ITS序列特征所构建的系统树，与传统分类有所不同。
[关键词] 独一味；PCR；ITS序列；分子系统进化
[中图分类号] R931 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）06（a）-０05－０3
Analysis of ITS gene sequence of Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo from the four locations in China
MIN Yunshan1, GU Xiuyan1, WANG Xin2,YANG Xiaoyuan1
1.Traditional Chinese Medicine Hospital of GanSu Province, LanZhou 730050,China;2.GanSu Traditional Chinese Medicine College, Lanzhou730000,China
[Abstract] Objective: To discover the ITS sequence of Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo, and to analyze the genetic diversity situation of Lamiophlomis rotata(Benth.) Kudo from four different areas which locate at MaQu of Gansu province, RuoErGaiDaoBan of Sichuan province, Linzhi of Tibet Autonomous Region and RuErGaiReDangBa of Sichuan province by the ITS sequence which was regarded Genetic Markers. Methods: Plant DNA Mini Kit Method was considered to be an optimal technique. Based on the genomic DNA extracted by Plant DNA Mini Kit method, a reaction system suitable for Lamiophlomis rotata(Benth.) Kudo was established,with synthetic peculiar PCR primer, internal transcribed spaced sequences of rRNA gene were amplified in DNA extracted from wild Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo. And then the electrophoretic atlas of NPPCR amplified products on the agar sugar gel were analysed and measure its genic sequence. Statistical analyzing and branch analyzing were carried out by Clusta 1x software and genetic distance difference in every kinds can be calculated and the molecular phylogenetic tree was established by MEGA3. Result: The electrophoresis atlas and sequencing showed that the lengths of the internal transcribed spaced regions of the rRNA gene in DNA from Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo. had the same region about 670bp. The genetic distance of Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo from MaQu GanSu province, LinZhi Tibet Autonomous Region was closer than from RuErGai DaoBan Sichuan province and RuErGai ReDangBa Sichuan province. Conclusion: Based on the ITS sequence analysis the genetic diversity among the Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo. from MaQu,GanSu province which is high quality and other areas is not distinct. The phylogenic tree derived from the dendrograms based on the ITS sequence data was set up by the NJ contained some discrepancy from the traditional classification.
[Key words] Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo; PCR; ITSsequence; Phylogenetics
独一味Lamiophlom is rotata (Benth.) Kud为唇形科植物，原属糙苏属(Phlom isLinn)，现已从该属中分出成为独立的属，称独一味属，仅1种，其根及根茎或全草入药，药材表面枯黄色或黄褐色，质坚硬、干枯、气腥臭，是我国藏、蒙、纳西等民族民间常用草药之一。独一味又名独步通[1]，始载于《月王药诊》、《四部医典》。独一味为常用藏、蒙药、藏药名达巴巴，亦称“大巴”、“打布巴”。蒙药名达巴格。《晶珠本草》谓：“独一味固精，引流黄水”[2]《中药大辞典》载：“性微寒，味苦；有小毒。功效活血，行瘀，消肿，止痛。主治跌伤筋骨，闪腰挫气，关节积黄水”等功能[3]。生长于海拔3 500 m以上，分布于我国甘肃、青海、西藏、四川、云南等地区。目前，独一味分子遗传标记的研究尚未见报道，笔者通过测定独一味ITS序列，初步分析独一味属的序列变异规律并构建了系统发育树，以期为独一味的分类研究、品种鉴别技术提供新的方法和依据，进一步科学的指导独一味种质资源的收集、分类和评价，推进独一味遗传育种与种质创新的发展。
1材料与方法
1.1 材料来源
所有材料均来源自野外，本试验选用了不同产地的4个独一味居群，所采集样本，-70℃冰箱中保存待用。所1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA提取
分别使用CTAB法、苯酚法、高盐低PH法、植物基因组小量抽提试剂盒（Plant DNA Mini Kit）（上海生工）提取植物基因组DNA，2%琼脂糖电泳检测，-20℃冰箱保存，备用。
1.2.2 引物设计
在保守区设计5条寡核苷酸引物。引物序列如下:
P-P1：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；
P1：5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGGA-3′；
P2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；
P3：5′-GCATC GATGA AGAACGCAGC-3′；
P4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 扩增策略
先用引物P-P1和P4扩增rDNA基因内转录间隔区全序列；其扩增产物经纯水稀释后，在分别应用引物P1和P2扩增ITS1序列；引物P3和P4扩增ITS2。有此完成套叠式聚合酶链式反应（nPCR）。
1.2.4 扩增循环
按下述程序进行扩增：①94℃预变性2 min；②93℃变30 s；③55℃退火30 s；④72℃延伸1 min；⑤重复步骤②～④35次；⑥最后一个循环72℃延伸 5 min；2%琼脂糖凝胶电泳检测产物DNA；置于多影像凝胶成像仪下观察结果，并拍照，保存；ITS区纯化、测序通过PCR扩增所得产物送上海生工纯化、测序。
2 数据分析及系统树构建
本试验将所获得的ITS碱基序列同时选用唇形科与独一味不同属的植物Phlomis x margaritae、Phlomis purpurea、Phlomis crinita subsp.Mauritanica、Phlomislychnitis、Ajugadecumbens、Rubiteucrispalmata、Cardioteucriscordifolia Schnabeliaoligophylla、Scutellariabaicalensis、Holocheilalongipedunculata Glech omahederacea、Salviaplebeian、Salviasplendens、Perillafrutescens的序列作为外类群，经Clusta 1x排序,用MEGA3软件基于Kimura-2-parameter模型计算遗传距离（表2），并采用近邻归群（Neighbor-Joining，NJ）法构建系统发育树（图1），系统树各分枝的置信度自举检测（bootstrap）2000次。各类群间的平均遗传距离为0.1757。各类群ITS长度和序列中的质量分数（表3）。
3 讨论
目前利用ITS序列分析技术进行分子鉴定和种群遗传多样性的研究已有不少报道，如谢晖等[4]用ITS序列9种柴胡属植物进行了分子鉴定学研究；林昕等[5]利用ITS序列作为遗传标记分析了来自3个不同地区的西施舌的遗传变异情况，还基于ITS序列分析了西施舌在蛤蜊科和双壳贝类中的分子系统进化地位。笔者通过PCR扩增，采用Chromas(version2．22)软件从序列峰图中提取核苷酸序列，ClustalX软件进行多序列比对分析，独一味的ITS的序列长度为670bp，ITS1序列长度约为210bp左右，ITS1序列长度约为240bp左右，序列分析结果表明，这4个产地独一味个体之间遗传差异较小，共计22个变异位点，9个信息位点，643个保守位。其中，甘南玛曲与西藏林芝独一味的遗传差异和遗传距离小，四川若尔盖道班与四川若尔盖热当坝遗传差异和遗传距离小，但与甘南玛曲和西藏林芝独一味遗传差异和遗传距离相对较大，两两之间为遗传相似度为97.80％～99.80％。
采用MEGA3.1软件，以唇形科内与独一味不同属植物为外类群，基于ITS序列分别构建了来自不同地区独一味NJ分子系统树分子进化树表明：四川若尔盖道班和四川若尔盖热当坝独一味在所做的3种进化树中均形成一支，甘南玛曲和西藏林芝独一味均形成另外一支。系统进化树一致表明四川若尔盖道班与四川若尔盖热当坝遗传距离较近，甘南玛曲与西藏林芝独一味遗传距离较近，这也和地理位置的距离远近及所在海拔、气候特征相一致。目前，关于独一味分子遗传标记的研究尚未见报道，ITS序列分析相对于RAPD技术有明显优势，这将有利于独一味优良品种的种植，从而避免独一味的盲目引种。
总之，该方法可行，对深入研究独一味有一定的意义。
[参考文献]
[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海科学技术出版社,1977:1707.
[2]清・帝玛尔.丹增彭措辑.晶珠本草[M].上海:上海科学技术出版社,1986:137.
[3]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草 [M].第7卷.上海:上海科学技出版社,1999:6074-6075.
[4]谢晖,晁志,霍克克,等. 9种柴胡属植物的核糖体ITS 序列及其在药材鉴定中的应用[J].南方医科大学学报,2006,26(10):1460-1463.
[5]林昕,梁君荣,高亚辉,等.3个地区西施舌的ITS-1基因片段序列分析[J].生命科学研究,2008,12(1):14-19.
（收稿日期：2011-03-21）
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
