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【摘要】目的:总结四种不同检验方法对慢性肝病的检验结果,以提高慢性肝病的早期诊断。方法:采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)、胶体金层析法(GIA)、免疫电子发光试验法(MEIA)和聚合酶链式反应法(PCR)检验72例慢性肝病的血清标志物。结果:4项检测方法中, PCR检测的相对总符合率高于其他三种方法检测(P0.05)。结论:在慢性肝病的检验中,不同方法的原理、成本、总符合率、复杂程度和耗时各有所不同,故有必要对这些方法进行综合评估,从而选择合适的检验方法。
【关键词】慢性肝病;检验方法;酶联免疫吸附试验法;胶体金层析法;免疫电子发光试验法;聚合酶链式反应法
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0221-01
检测慢性肝病的方法虽多,但目前没有一项特异性试验对某一种肝脏疾患的病因病变程度作出准确的反映,也没有任何一种检查能单独反映肝脏病变而不受其它因素的影响;且肝脏有较强的再生能力和代偿机能,当病变范围不大,时间不长时,肝功检查可无异常,故肝功能检查即使正常也不能说明肝脏没有病变。因此对肝病患者选择肝功能检测项目时,应全面考虑,并结合临床作具体分析。目前,实验室常规做慢性肝病检验多采用快速酶联免疫吸附试验法(ELISA)、胶体金层析法(GIA)和免疫电子发光试验法(MEIA)。近年来,随着免疫学方法的不断更新,临床检验慢性肝病的方法已普遍采用聚合酶链式反应法(PCR)。现对我院2008年2月-2009年4月72例乙型肝炎的四种检测方案进行分析,旨在为临床合理检测提供参考。
1 资料与方法
1.1 资料来源:研究对象为我院2008年2月-2009年4月住院的72例HBeAg、HBeAb双阳性慢性肝病患者,其中男62例,女10例,年龄23～77岁,均除外免疫耐受状态的HBV携带患者以及HCV、HDV、HAV、HEV等肝炎病毒重叠感染的病例。所有患者诊断均符合2005年慢性乙型肝炎防治指南诊断标准。
1.2 检验方法
1.2.1 联免疫吸附试验法:ELISA使标记抗原和抗原与限量抗体发生竞争性结合,反应平衡后,加入分离剂,使游离抗原与抗原抗体复合物分离,测定沉淀中放射性强度;加入标本后,再用酶标记的抗原或抗体测定抗体或抗原,使底物显色。所有标本均当天用ELISA法测定,仪器为罗氏ELECSYS2010全自动免疫电化学发光分析仪。试剂为罗氏公司所提供的乙肝两对半相配套试剂,严格按仪器操作规程及试剂说明书操作。
1.2.2 胶体金层析法:胶体金的制备参照Frens方法制备:超纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01%,取100ml加热煮沸,加入1%柠檬酸三钠溶液1.0ml,继续煮沸15min,直至溶液由白变蓝再变红即为制备好的胶体金溶液,置室温冷却备用。测试条由吸水滤纸;玻璃纤维滤纸;吸附着干燥的金标鼠抗IgM抗体;硝酸纤维素膜;吸水滤纸四部分依次相互重叠相连粘贴于白色塑料片上组成。在检验中,测试条的加样端浸入用生理盐水1∶10稀释的待测血清中,深度应在距吸附着金标抗体的玻璃纤维滤纸以下8～10mm处,5～10min内进行结果判定,红色“+”出现为阳性,红色“1”出现为阴性,如无红色线条出现,则表明测试条失效。
1.2.3 免疫电子发光试验法:MEIA法采用美国雅培公司AXSYM全自动酶免分析仪,测定用的试剂、定标液及质控液等均来自雅培公司。
1.2.4 PCR法:在本组PCR检测中,试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心生产,用裂解液提取DNA模板总反应体系为20ta,扩增片段为314 bp。各反应管置入5700自动荧光检测仪中,按93℃ 2min预变性,93℃ 30s、55℃ 30s,72℃ 1min进行40个循环,结果荧光定量PCR由电脑自动计算DNA含量。
1.3 统计指标:总符合率=(真阴性数+真阳性数)/(真阴性数+假阴性数+真阳性数+假阳性数)×100%。
1.4 统计分析:实验数据用SPSS15.0程序进行统计学处理。以P0.05)。具体情况见表1。
3 讨论
当前检测乙型肝炎病毒(HBV)主要依靠血清学方法,目前常用的检测方法有:免疫扩散、对流免疫电泳(CIEP)、补体结合(CF)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、胶体金层析法(GIA)和免疫电子发光试验法(MEIA)、间接血凝(PHA)、反向间接血凝(RPHA)、免疫粘附血凝(IAHA)等。
ELISA方法以反应时间短、仪器设备简单、技术要求低成为首选。但不同的诊断试剂,由于采用不同形式的抗原建立检测抗体,其检测结果也可能不同按传统的说法,全病毒抗原包被的试剂特异性和敏感性不如基因工程表达抗原的好,因为全病毒靠细胞培养技术得到病毒抗原,在细胞中含有其他的蛋白而影响其特异性和敏感性。但如果全病毒抗原在提取和纯化工艺上处理得好,其特异性和敏感性还是明显高于表达抗原,ELISA-2正说明这个道理。免疫层析是一种快速免疫分析技术,最早应用于早早孕诊断,现已用于多种传染病、寄生虫感染的检测,如:应用免疫层析技术检测狂犬病毒、恶性疟原虫。免疫层析技术是以微孔膜为固相载体,膜上包被已知抗原或抗体,加入待测样本后,经微孔膜的毛细虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗体或抗原结合,通过胶体金标记物(或其它指示剂)标示反应结果。免疫电子发光试验法与免疫层析原理类似,不过由于其在检测中采用了电镜观察,会在一定程度上提高检测符合率。PCR技术作为一种新技术,具有快速、准确、灵敏等优点,又能同时平行检测大量样本,具有广泛的应用价值。本组结果表明,对于慢性肝病的检验,PCR检测的相对总符合率高于其他三种方法检测(P0.05)。不过由于实验时间长,制备的成本高,制作过程复杂,使用率低浪费严重,核酸杂交反应的特异性与检测的灵敏度不够理想,难以建立标准化数据库,这在一定程度上不能使PCR技术成为实验室研究或者临床可以普遍采用的技术。
同时在慢性肝病死种检测方法中,不同方法的原理、成本、总符合率、复杂程度和耗时各有所不同,故有必要对这些方法进行综合评估,但目前有关检测方法的综合评价研究很少,尚无较成熟的专门从检验医学及经济学角度评价检验项目或方法的评价方法,这还需要我们进一步研究。
参考文献
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作者单位:524008 广东省湛江市港区人民医院检验科�1
524005 中国人民解放军第422医院检验科�2
