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【摘要】 目的 观察高糖作用人脐静脉内皮细胞时c-fos基因mRNA和蛋白的表达的变化。方法 提取并体外培养人脐静脉内皮细胞,分别加入不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、44 mmol/L)并分别作用不同时间,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测c-fos基因mRNA的表达,免疫细胞化学检测c-fos蛋白表达。结果 经高糖处理的人脐静脉内皮细胞中,c-fos基因mRNA的转录水平明显高于对照组(P 3.2 高糖对c-fos 基因表达的影响
3.2.1 总RNA的鉴定 总RNA提取产物在紫外分光光度计下测A260/A280的OD比值在1.8~2.0之间。经1.0%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下可见2条清晰的条带,分别28 s、18 s,且28 s/18 s>1.5,示RNA无明显降解。
3.2.2 c-fos在HUVECs中的转录 PCR扩增后的产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后于凝胶图像分析系统摄像,进行灰度分析,结果见下图1、2,c-fos和GAPDH扩增片段分别为150 bp和420 bp,与理论设计相符。
图1 不同处理因素对c-fos mRNA转录的影响
图2 22 mmol/L Glu作用不同时间c-fos mRNA转录
3.2.3 葡萄糖浓度对c-fos mRNA转录的影响 选取5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、44 mmol/L浓度组以观察葡萄糖对c-fos基因转录的浓度影响。从图1可以看出,各组GAPDH mRNA水平相差不大,但c-fos mRNA的量从5.5~22 mmol/L随葡萄糖浓度增加而逐渐增高(P0.05)。相关灰度比值数据从略。
4 讨论
c-fos属于即刻早基因,正常情况下在大多数细胞都有极低水平的表达,参与细胞的正常生长、增殖、分化、调节细胞内信息传递等生理过程。在受到多种伤害性时,能迅速表达,参与细胞的凋亡、修复等过程。但一般来说,其表达快速、短暂;mRNA半衰期短,不稳定;并且通过亮氨酸拉链结构与Jun蛋白形成异源性二聚体复合物,即具有活性的转录因子复合物AP-1,AP-1通过顺式作用激活相关的基因,从而调节基因的表达与蛋白质的合成[3]。
本研究发现高糖(22 mmol/L)作用下, HUVECs中c-fos的mRNA水平在1 h左右达到高峰,随后下降。随葡萄糖浓度增高c-fos mRNA表达量也增加,葡萄糖浓度至22 mmol/L达最高峰,44 mmol/L时下降,其原因可能与葡萄糖浓度过高毒性作用增加抑制细胞活性等有关。c-fos蛋白表达也随时间延长而逐渐增高,至2 h达最高峰,随后下降,与其他研究基本一致[4]。甘露醇组c-fos mRNA转录和蛋白表达无明显增高。
高糖引起HUVECs c-fos转录和蛋白合成增加的原因未明,目前认为可能与PKC通路激活有关,笔者前期的工作也发现了类似结果。AP-1是PKC的经典核内靶分子。高糖激活PKC通路的机制如下:①从头合成(de novo)途径:高糖经酵解产生中间产物,逐步酰化合成DAG,此为高糖激活PKC的主要途径;②磷脂酶D水解磷脂酰胆碱生成DAG途径;③山梨醇通路激活、蛋白质非酶糖化、氧化应激均可使DAG生成增加而激活PKC[5]。
笔者发现高糖时HUVECs中PKC通路激活一方面可以引起VEGF的转录和蛋白质合成增加[6],因此可能导致血管内皮细胞增生,新生血管形成;另一方面引起c-fos转录和蛋白合成增加,从而导致内皮细胞的凋亡[7]。具体哪方面因素何时占主导地位,可能是一个值得研究的课题。在此,不妨可以大胆假设一下:在糖尿病的早期,以第一条途径为主,此时表现出来的是内皮细胞增生,血管内皮层较为完整;至中晚期,则第二条途径占主导地位,因此出现内皮细胞的凋亡,血管内皮层的破坏,进而出现糖尿病大血管的典型病变。
参 考 文 献
[1] 王立岩,冬晓红,宫桂兰,等.人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察. 白求恩医科大学学报,2000,26(1):26-28.
[2] Shinichi Sakurai, Shahabuddin Alam, Glorivee Pagan-Mercado,et al. Retinal Capillary Pericyte Proliferation and c-fos mRNA Induction by Prostaglandin D2 through the cAMP Response Element. Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43:2774-2781.
[3] Liang F, Seyrantepe V, Landry K, et al. Monocyte differentiation upregulates the expression of the lysosomal sialidase, neul, and triggers its targeting to the plasma membrane via major histocompati-bility complex class Ⅱ-positive compartment. J Biol Chem, 2006, 281(37):27526-27530.
[4] 宋冰,魏执真,吕仁和.中药糖心宁口服液对血管平滑肌细胞原癌基因c-myc和c-fos表达的影响.中医杂志,2004,45(4):292-294.
[5] Scivittaro V, Ganz MB, Weiss MF. AGEs induce oxidative stress and activate protein kinase C-βⅡ in neonatal mesangial cells. Am J Physiol, 2000,278:F676-683.
[6] 刘小鹏,罗春英,曹仁贤,等. 高糖作用下HUVECs中VEGF基因表达与PKC通路的关系研究.中国动脉硬化杂志,2006,14(1):17-20.
[7] 罗春英,刘小鹏,文格波,等.p38丝裂素活化蛋白激酶在高糖损伤人脐静脉内皮细胞中的作用.中国动脉硬化杂志,2006,14(10):853-856.
