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【摘 要】目的研究依达拉奉对创伤性脑损伤大鼠脑组织细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响。方法 72只SD 大鼠随机分为依达拉奉治疗组、对照组和假手术组,按伤后6、12、24、48 h分成12组(每组6只)。建立大鼠自由落体脑损伤模型(Feeney′s model),用免疫组织化学染色及原位细胞凋亡检测法(TUNEL法)测定各个组大鼠伤后6、12、24、48 h脑组织Bcl-2蛋白表达和凋亡细胞数。结果 依达拉奉治疗组各时间点细胞凋亡数均明显小于对照组及假手术组的(P<0.01);各个时间点的Bcl-2蛋白表达均明显高于对照组及假手术组的(P<0.01)。结论 依达拉奉可以上调创伤性脑损伤大鼠脑组织的Bcl-2蛋白表达,抑制细胞凋亡。
【关键词】 依达拉奉;创伤性脑损伤;细胞凋亡;Bcl-2
Effect of edaravone on cell apoptosis and expression of bcl-2 following traumatic brain injury in ratsWANG Feng-he.Department of Neurosurgery,People′s Hospital of Yanzhou,Shandong 272000,China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of edaravone on the cell apoptosis and the expression of bcl-2 following traumatic brain injury in rats.Methods 72 SD rats were randomly divided into 3 groups:edaravone -treatedgroup,controlgroup andsham group,and were further divided into 6,12,24,48 hours subgroups according to the time of injury(n=6).Based upon the Feeney′s model,immunohistochemical method and TUNEL staining were used to determine the expression of the bcl-2 protein and number of TUNEL-positive apoptotic cells in the brain tissue at6,12,24,48 hours after injury.Results After 6,12,24,48 hours of injury,the number of TUNEL-positive apoptotic cells in the edaravone-treated group were obviously smaller than that in the control group and sham group (P<0.01),while,the expression of bcl-2 protein was obviously higher in the edaravone-treated group than that in the control group and sham group(P<0.01).Conclusion Edaravone inhibits the neuronal apoptosis following traumatic brain injury in rats,which might be relation with the up-regulated bcl-2 protein expression.
【Key words】 Edaravone;Traumatic brain injury;Cell apoptosis;Bcl-2
创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI) 在临床常见,病死率高,后遗症多,对患者危害较大。目前认为脑损伤后迟发性神经元凋亡是产生继发性脑损害的主要途径[1],如何阻止脑损伤后迟发性神经元凋亡是当前临床治疗脑损伤的研究热点之一。目前,依达拉奉对创伤性脑损伤后大鼠神经细胞凋亡影响的研究少见报道,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要实验仪器与试剂 自制改进型Feeney 自由落体脑损伤装置。原位细胞凋亡检测试剂盒,购自Roche公司。Bcl-2 及Bax免疫组化染色试剂盒,购自武汉博士德生物工程有限公司。Leica R M2235 型切片机,购自德国Leica公司。
1.2 实验动物分组及处置 健康成年雄性SD 大鼠72只(中南大学实验动物学部提供),体质量200~250 g,随机分为假手术组,脑损伤组,其中脑损伤组又分为依达拉奉治疗组和对照组,按伤后6、12、24、48 h观察点分成12组(每组6只)。
依达拉奉治疗组:依达拉奉由江苏先声药业公司提供,大鼠用量为每次3�/�,于造模后立即经尾静脉推注给药,2次/d。对照组脑损伤情况同依达拉奉治疗组的,于造模后立即经尾静脉推注给等依达拉奉治疗组体积的生理盐水,2次/d。假手术组仅做颅骨钻孔,于造模后均立即经尾静脉推注等依达拉奉治疗组体积的生理盐水,2次/d。
1.3 实验模型准备 实验模型采用自制改进型Feeney 自由落体脑损伤装置。用40 g砝码从25 cm高处坠落致重型脑损伤。假手术组仅做颅骨钻孔而不脑致伤。
1.4 组织切片的制备 在各观察点,用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,用4%多聚甲醛固定、取脑、脱水、常规石蜡包埋,以出血部位为中心冠状位连续切取切片。
1.5 细胞凋亡检测 采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法),具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.6 Bcl-2 蛋白检测 采用免疫组织化学SP法,具体操作步骤按试剂盒说明书进行。鼠抗Bcl-2多克隆抗体,工作浓度分别为1∶100 和 1∶75 。Bcl-2以细胞胞质呈棕黄色着色为阳性细胞。
1.7 图像分析 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统,于200倍光镜下选择血肿周围阳性细胞表达明显区域的3个相邻视野,计数阳性细胞数,计算平均值。
1.8 统计学分析 所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS10.0统计学软件进行方差分析及齐性检验。其中两组间均数间比较用t检验;计数资料用χ2检验;等级资料用秩和检验。
2 结果
2.1 细胞凋亡检测结果 假手术组颅骨钻孔6 h后出现细胞凋亡,至48 h渐增,但变化幅度不大。对照组脑损伤6 h后细胞凋亡明显增高,且在观测点48 h内一直增高。依达拉奉治疗组中,脑损伤6 h后细胞凋亡明显增高,但比对照组增高的幅度明显低(P<0.01),见表1。
2.2 Bcl-2 蛋白检测结果 假手术组Bcl-2 蛋白表达阳性细胞数较低;对照组比假手术组Bcl-2 蛋白表达阳性细胞数高(P<0.01);依达拉奉治疗组比对照组及假手术组Bcl-2 蛋白表达阳性细胞数都高(P<0.01)。
3 讨论
依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5酮,MCI-186)是相对分子量为174.20的亲脂性基团,血脑屏障的通透率为60%[2],静脉给药后可以清除脑内具有高度细胞毒性的羟基基团,并抑制迟发性神经元死亡[3]。
本实验结果显示,脑损伤后存在细胞凋亡,伤后6 h细胞凋亡明显增高,且在观测点48 h内一直增高,与莫纪华等[4]的观测结果一致。而依达拉奉治疗组的细胞凋亡个数在脑损伤后各个观测时间点上与对照组比较增高的幅度明显低(P<0.01),提示依达拉奉存在抑制细胞凋亡的作用。
Bcl-2 是一种凋亡抑制基因,主要通过阻止细胞凋亡的早期环节而发挥作用,它能够阻止或降低染色质浓缩和DNA裂解的发生。其作用可能通过多种途径而实现,其中研究较多的包括Bcl-2蛋白与凋亡蛋白Bax形成异源二聚体抑制细胞凋亡的发生以及对凋亡关键性蛋白Caspase-3活化的抑制。Bcl-2蛋白表达超过Bax蛋白表达时抑制细胞凋亡[5]。本实验结果显示,依达拉奉治疗组的Bcl-2蛋白表达在各个观测时间点上均明显高于对照组及假手术组的(P<0.01),提示依达拉奉有促进Bcl-2蛋白表达的作用,并进而发挥抑制细胞凋亡的作用。同时本实验结果显示,假手术组仅做颅骨钻孔而不脑致伤,在各个观测时间点上Bcl-2蛋白表达亦增高;结合杨继文等[6]对不做特殊处理的正常大鼠Bcl-2蛋白表达测定0.00±0.0结果分析,颅骨钻孔这一干预措施,也能引发某一机制使Bcl-2蛋白表达轻度增高。
综上所述,依达拉奉能促进脑损伤大鼠脑组织Bcl-2蛋白的表达,而发挥抑制细胞凋亡的作用,进而阻断发生继发性脑损害的主要途径。依达拉奉在创伤性脑损伤中有应用价值,值得进一步临床研究与推广。
参考文献
1 Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat.Am J Pathol,1995,147(6):1575-1583.
2 Takamatsu Y,Yuki S,Watanabe T.Studies on the concentration of 3-methyl-1-phenyl-2 -pyrazolin-5-one (MCI-186) in MCA occlusion and reperfusion model of rats.Jpn Pharmacol Ther,1997,25 (l):1785-1792.
3 Masahiro B,Tetsuya M,Hideki K,et al.The radical scavenger edaravone prevents oxidative neurotoxicity induced by peroxynitrite and activated microglia.Neuropharm,2005,48(3):283-290.
4 莫纪华,郑秀珏,杨小锋.大鼠严重脑损伤后细胞凋亡状态及相关基因Bcl-2、Bax 的表达.中华创伤杂志,2004,20(7):432-433.
5 Almeida OF,Conde GL,Crochemore C,et al.Subtle shifts in the ratio between pro- and anti- apoptotic molecules after activation of corticosteroid receptors decide neuronal fate.FASEB J,2000,14(5):779-790.
6 杨继文,王威,袁曙光,等.黄芪合丹参注射液对急性脑出血大鼠神经细胞凋亡表达的影响.中华中医药杂志,2007,22(10):720-722.