【www.zhangdahai.com--教学工作总结】
[摘要] 目的：探讨米非司酮对乳腺癌细胞系MCF-7/ADM裸鼠移植瘤耐药逆转作用。方法：以人乳腺癌细胞系MCF-7/ADM建立耐阿霉素人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤动物模型，将成瘤裸鼠随机分为空白对照组，米非司酮组（MIF组），阿霉素组（ADM组），米非司酮联合阿霉素组（MIF+ADM组）。测量裸鼠移植瘤横径与短径，计算移植瘤体积，绘制生长曲线。结果：对裸鼠干预处理4周后，MIF+ADM组移植瘤体积[（232.514 9±309.237 7） mm3]最低，ADM组[（508.964 8±16.260 9） mm3]次之，均低于空白对照组移植瘤体积[（962.230 9±261.131 3） mm3]，差异有统计学意义（P＜0.05）；MIF+ADM组移植瘤体积较单独用药的MIF组及ADM组低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：米非司酮有逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADM裸鼠移植瘤耐药性的作用。
[关键词] 乳腺癌；多药耐药；米非司酮；移植瘤
[中图分类号] R737.9 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）08（a）-０28－０3
Reversal effect of mifepristone on MCF-7/ADM cell line in breast cancer xenograft of nude mice
HUANG Yuting1, Huang Junhui2, ZHU Ming3
1.Department of Radiotherapy Oncology, Huizhou Municipal Central Hospital, Guangdong Province, Huizhou 516001, China; 2.Department of Chemotherapy Oncology, Xiangya Hospital Central-south University, Hunan Province, Changsha 410008, China; 3.Department of Cardiothoracic Surgery, Huizhou Municipal Central Hospital, Guangdong Province, Huizhou 516001, China
[Abstract] Objective: To research the reversal effect of mifepristone on MCF-7/ADM cell line in breast cancer xenograft of nude mice. Methods: Established adriamycin resistance human breast cancer animal models that xenofraft transplanted subcutaneous in nude mice by adriamycin resistance cell line of human breast cancer MCF-7/ADM. The mice with xenofraft were divided into four groups randomly, control group，mifepristoneon group (MIF)，adriamycin group(ADM)，mifepristone+adriamycin group(MIF+ADM). Measured the xenografts′ long and short diameters，calculated the volumes of xenofrafts and drew the growth curve. Results: After the 4 weeks′ treatment, the xenograft volume of mifepristone+adriamycin group [（232.514 9±309.237 7） mm3] was the smllest, adriamycin group [（508.964 8±16.260 9） mm3] smaller, compared with control group[（962.230 9±261.131 3） mm3], with statistical significance (P＜0.05). The xenograft volume of mifepristoneon+adriamycin group was smaller than mifepristone group and adriamycin group (P＜0.05). Conclusion: Mifepristone can reverse the resistant effect of breast cancer cell MCF-7/ADM xenograft of nude mice in vivo.
[Key words] Breast cancer; Multidrug resistance; Mifepristone; Xenofraft
乳腺癌是一种化疗敏感的实体瘤[1]，阿霉素（adriamycin，ADM）为其中一种有效率最高的化疗药[2]。但因多药耐药（multidrug resistance，MDR）极大影响化疗效果[3] 。目前有许多抗肿瘤多药耐药性的逆转剂被尝试应用于临床，因其毒副作用大而限制其应用。有研究表明米非司酮（mifepristone，MIF）可以逆转胃癌、肺癌、卵巢癌等多种耐药细胞的耐药性[4]，并因毒副作用小，有望成为一种新型逆转剂。本实验建立耐阿霉素的人乳腺癌细胞系MCF-7/ADM裸鼠皮下移植瘤模型，观察MIF及MIF联合常见乳腺癌化疗药物ADM对裸鼠移植瘤生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
米非司酮（10 mg/片，浙江仙琚制药股份有限公司），阿霉素（10 mg/瓶，浙江海正药业）。耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADM细胞，购自上海肯强公司，使用1640培养基进行培养（10%灭活小牛血清，1 μmol/L阿霉素、青霉素100 U/ml、链霉素0.1 mg/ml）。由湘雅医学院实验动物学部提供的BALB/C遗传背景4周龄雌性裸鼠24只（10~16 g），饲养于SPF级动物实验室内。
1.2方法
取对数生长期细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液，调整浓度至1×108个/ml，超净工作台内以TB空针皮下注入裸鼠背部血管丰富处，每只裸鼠接种0.1 ml（含细胞数1×107个）。待背部移植瘤长至粟粒大小（10 d左右），用随机数字表将裸鼠分为4组：①空白对照组，0.9%NaCl溶液（NS）腹腔注射0.2 ml+食用油灌胃0.5 ml；②MIF组，NS腹腔注射0.2 ml +MIF灌胃30 mg/kg；③ADM组，食用油灌胃0.5 ml+ ADM腹腔注射5 mg/kg；④MIF+ADM组，MIF灌胃30 mg/kg+ADM腹腔注射5 mg/kg。每3天给药1次，共4周。自给药第1天起，测量移植瘤大小、记录其生长情况。以游标卡尺每3天测量移植瘤长径（a）及短径（b），并计算其体积（瘤体积=0.5×a×b2[5]），绘制生长曲线。计算各实验组的抑瘤率[抑瘤率=（空白对照组瘤平均体积-治疗组平均体积）/空白对照组平均瘤体积×100%]。
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析各组裸鼠移植瘤体积。结果以均数±标准差（x±s）的方式表示，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 裸鼠体内成瘤情况
自接种后1周左右出现肉眼可见的移植瘤，24只裸鼠中有20只成瘤，成瘤率达83.33%（20/24）。实验过程中，对照组、MIF组各有1只裸鼠出现肿瘤消退现象，ADM组、MIF+ADM各有1只荷瘤裸鼠因药物误灌入气管死亡，余各组裸鼠及移植瘤生长良好。
2.2 裸鼠移植瘤体积及生长曲线
2.2.1裸鼠移植瘤体积干预4周裸鼠移植瘤体后，以颈椎脱臼法处死裸鼠，切取移植瘤，计算各组移植瘤体积的大小及抑瘤率。从裸鼠移植瘤的平均瘤体积看，空白对照组瘤体积较其他各组大，与ADM组及MIF+ADM组相比，差异有统计学意义（P＜0.05)；MIF+ADM组瘤体积较两个单独用药组低，差异亦具统计学意义（P＜0.05）。计算各组抑瘤率后发现，MIF+ADM组抑瘤率最高，其次为ADM组，见表1、图1。
2.2.2各组裸鼠移植瘤生长曲线见图2。
3 讨论
乳腺癌是妇女中最常见的恶性肿瘤之一，因此对其有效治疗十分重要。ADM是治疗乳腺癌的经典化疗药物之一，单用有效率可达30%~45%。但是，临床上有些患者对其反应性差，对ADM产生耐药性是其中一个重要的原因，还可因此产生多药耐药，使得肿瘤细胞对于其他化疗药物亦不敏感。多药耐药其产生机制，包括：①转运蛋白介导的MDR机制，细胞膜p-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、肺耐药相关蛋白（LRP）等；②酶系统介导的MDR机制，谷胱甘肽（GSH）依赖性解毒酶系统[6]、DNA拓扑异构酶Ⅱ(DNA topoⅡ)、葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）等；③DNA修复介导的MDR机制；④其他包括与细胞凋亡有关的因子和基因（如p53，bcl-2）、P-糖蛋白磷酸化相关酶蛋白激酶C（PKC）、金属硫蛋白等相关MDR机制。
米非司酮是妇科常用药，炔诺酮的衍生物，能与孕激素的受体竞争结合。孕激素有刺激乳腺癌细胞增殖的作用，而MIF作为孕激素受体拮抗剂可以抑制乳腺癌的生长，在临床中用于乳腺癌治疗。随着对其作用机制的深入了解，发现米非司酮可通过多种途径增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。P-gp是一种药物外排泵，可与细胞内各种抗肿瘤药物结合，将它们泵出从而降低细胞内的药物浓度，影响化疗疗效。20世纪90年代初，Gruol DJ等[7]发现米非司酮通过与人和鼠的p-gp结合，抑制p-gp外排泵功能，达到逆转细胞对药物的耐药性。某些肿瘤细胞如肺癌细胞GLC4/Sb30并不表达p-gp，而过度表达MRP。Payen L等[4]在1997年首次发现MIF可下调人此细胞系的耐药性，故推论MIF可能通过下调耐药细胞株的MRP使细胞内药物浓度增加发挥作用。当血浆中MIF达到10 uM的浓度时，即具有抑制P-g和逆转MRP的功能。1999年Lucci A等[8]发现MIF通过作用于GCS酶系统，可阻断神经酰胺向葡萄糖苷基神经酰胺（GlcCer）转化，而逆转MCF-7/ADM细胞对ADM的耐药性。综上所述，MIF可能通过以上机制下调MIF+ADM组中移植瘤细胞的耐药性，逆转其耐药作用，在一定程度上恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，使该组抑制瘤生长受抑最显著。国内有体外实验发现MIF有一定程度的抗肿瘤作用[9]。此作用也可能是引起MIF+ADM组与其他组移植瘤体积差异的原因之一。
不仅在乳腺癌，在其他各种肿瘤的化疗中，肿瘤多药耐药是影响化疗效果的一个重要因素，并可导致复发与转移。肿瘤多药耐药性的产生机制十分复杂，针对其机制，有许多的耐药逆转剂不断地被发现，但因其毒副作用大等原因使其无法广泛应用于临床。而MIF作为耐药逆转剂，其安全性已有相关研究证明。早在20世纪相关文献显示单次服用50~60 mg，及长期口服25~200 mg/d，其不良反应较少，可耐受性好，并且可发挥逆转耐药作用[10]。但是，MIF成为一种新型逆转剂应用于临床仍需行进一步研究。随着对逆转剂的深入研究，最终将寻找到适合的途径解决肿瘤多药耐药的问题。
[参考文献]
[1]Burger H, Foekens JA, Look MP, et al. RNA expression of breast cancer resistance protein, lung resistance-related protein, multidrug resistance-associated proteins 1 and 2, and multidrug resistance gene 1 in breast cancer: correlation with chemotherapeutic response[J].Clin. Cancer Res,2003,9(2):827-836.
[2]潘其刚,李艳萍.CMF方案与CMF+ADM治疗乳腺癌的疗效比较[J].广东医学院学报,2003,9(21):278-279.
[3]鄢希.肿瘤多药耐药机制及其逆转剂研究进展[J].华西医学,2008,23(3):662-663.
[4]Payen L, FAU-Delugin L, Courtois A, et al. Reversal of MRP-mediated multidrug resistance in human lung cancer cells by the antiprogestatin drug RU486[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999,258(3):513-518.
[5]Tanaka M, Obata T, Sakaki T.Evaluation of antitumor effects of docetaxel (taxotere) on human gastric cancer in vitro and in vivo Eur[J].Cancer,1996,32A(2):119-122
[6]杜芹.肿瘤耐药机制及其逆转措施的研究[J].实用癌症杂志,2008,23(4):427-429.
[7]Gruol DJ, Bourgeois S. Expression of the mdr1 P- glycoprotein gene:a mechanism of excape from glucocorticoid-induced apoptosis[J]. Biochem Cell Biol,1994,72(11-12):561-571.
[8]Lucci A,Han TY,Liu YY,et al.Ceramide toxicity and metabolism differ in wild-type and multidrug-resistant cancer cells[J].Int J Oncol,1999,15(3):535-540.
[9]柯佩琪,郑闻亭,朱云晓,等.MIF对人耐药卵巢癌细胞系SK.OV.3的增殖及DDP耐药性的影响[J].中山大学学报:医学版,2004,3(s):223-225.
[10]Gerdes J, Sehwab U, Lemke H, et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation[J].Int J Cancer,1983,31(1):13-20.
（收稿日期：2011-04-29）
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
