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【摘要】目的通过基因工程的方法克隆人神经营养素-3成熟蛋白(hNT-3)的基因，并在大肠杆菌中进行表达，为研究hNT-3的生物学作用提供材料。方法以人胎脑cDNA为模板，采用PCR方法扩增hNT-3基因，并将其克隆在pGEM-T载体上，将经过序列分析确定的hNT-3基因插入原核表达载体pGEX-6p-1中，构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3，用SDS-PAGE法测定其在大肠杆菌中的表达。结果经序列测定分析，所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank, MW002527)同源性为99.7%，并获得了高效表达hNT-3蛋白的重组菌株。结论体外成功扩增hNT-3基因，并在原核细胞中高效表达。
【关键词】神经营养素-3；PCR；基因克隆；原核表达
神经营养因子（neurotrophic factor，NTF）是机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类蛋白质。神经营养素家族（neurotrophin family， NTs）是“经典的”神经营养因子，包括神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）、神经营养素-4/5（neurotrophin-4/5，NT-4/5）、神经营养素-6（neurotrophin-6，NT-6）和神经营养素-7（neurotrophin-7，NT-7）。
神经营养素-3，分子量为13.6 KD，等电点9.3，人NT-3基因定位于染色体12p13区，编码258个氨基酸残基的前体蛋白，裂解后得到由119个氨基酸残基构成的成熟蛋白，NT-3广泛分布于外周和中枢神经系统内，主要在海马、背根节、脑干、脊髓等。研究表明NT-3功能广泛，可在体或离体调节周围和中枢神经系统神经元形态[1]；维持胚胎发育中神经元存活、促进其分化与增殖[2]；诱导其轴突生长[3]以及调控成熟神经元生理功能[4]和促进损伤神经元修复。
1 材料和方法
1.1材料胎脑组织取自引产胎儿；菌株E. coli JM109、E. coli BL21(DE3) pLysS、质粒pGEX-6p-1由本实验室保存；质粒pGEM-T，M-MLV反转录酶购自Promega公司；Trizol购自MIC公司；LA Taq DNA聚合酶，EcoR I、Sal I，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。
1.2方法
1.2.1引物设计与合成根据Genbank发表的人NT-3序列(MW002527)设计2条引物，上游引物导入EcoR I酶切位点，由上海生工生物技术公司合成。引物序列如下：
上游引物NT3-S（24bp）：5"- GAA TTC TAC GCG GAG CAT AAG AGT -3"， 引入一个EcoRⅠ酶切位点；
下游引物NT3-A（21bp）：5"- TGC CAA TTC ATG TTC TTC CGA -3"。
1.2.2RT-PCR 用Trizol试剂抽提人胎脑总RNA，以oligo dT(18)为引物，反转录合成cDNA第一链作为模板，用NT-3特异引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环。
1.2.3克隆载体的构建与序列分析用DNA纯化试剂盒回收纯化PCR产物，再将其克隆至pGEM-T载体中，构建克隆载体pGEM-T-NT-3，转化入E. coli JM109感受态细胞，经酶切鉴定阳性重组子后，由上海英骏(invitrogen)生物技术公司测序。
1.2.4原核表达载体的构建：用EcoR I和Sal I自重组克隆载体pGEM-T-NT-3切下NT-3编码序列，电泳回收目的片段并连接至经相应酶处理线性原核表达载体pGEX-6p-1，构建原核表达载体pGEX-6p-1-NT-3，转化入E. coli BL21(DE3) pLysS感受态细胞。经筛选及酶切鉴定， 挑选出阳性重组质粒。
1.2.5融合蛋白在大肠杆菌中的表达挑取阳性重组质粒pGEX-6p-1-NT-3单菌落接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，次日以1:50扩配，继续37℃振摇培养至培养液的OD600达0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，诱导培养4 h，收集菌体，重悬于PBS(pH7.4)，超声处理，用SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量，考马斯亮蓝R-250染色。
1.2.6融合蛋白最佳表达条件的确立
1.2.6.1最适诱导时间的选择将阳性重组质粒pGEX-6p-1-NT-3单菌落37℃培养至OD600达0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，分别诱导培养2、4、6、8、10、12 h，经SDS-PAGE分析，选择最适诱导时间。
1.2.6.2最适诱导剂浓度的选择将阳性重组质粒pGEX-6p-1-NT-3单菌落37℃培养至OD600达0.4-0.6，加入IPTG分别至终浓度为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mmol/L，诱导培养4 h，经SDS-PAGE分析，选择最适诱导剂浓度。
1.2.6.3最适诱导温度的选择：将阳性重组质粒pGEX-6p-1-NT-3单菌落37℃培养至OD600达0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，分别于37℃和28℃诱导培养4 h，超声处理菌体后离心，经SDS-PAGE分析，观察诱导温度对可溶性融合蛋白所占比例的影响。
2 结果
2.1NT-3基因的扩增RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见约400 bp左右的特异性条带 见图1。
2.2克隆载体的构建与序列分析将PCR扩增得到的目的基因片断经回收，与pGEM-T载体连接，转化E. coli JM109后得到单菌落若干。选取10个单菌落提取质粒，经EcoR I、Sal I双酶切，琼脂糖凝胶电泳可见约400 bp左右的特异性条带 见图2，初步鉴定为阳性重组子。对其进行DNA序列分析，测序结果表明扩增的DNA片断与发表文献报道的人NT-3序列(Genbank MW002527)同源性为 99.7%。
2.3原核表达载体的构建：限制性酶切分析表明，所构建的重组原核表达载体pGEX-6p-1-NT-3含有372 bp的目的基因片段 见图3。
2.4融合蛋白在大肠杆菌中的表达及最佳表达条件的确立：原核表达载体阳性菌落于37℃以IPTG为诱导剂诱导培养，并制备成SDS-PAGE样品，用12�分离胶的SDS-PAGE分析，结果发现有一条明显表达的目的条带，其分子量约40kD，大小与理论推算的GST-NT-3融合蛋白相对分子质量相符合。
2.4.1最适诱导时间的选择：原核表达载体阳性菌落于37℃分别诱导培养2h、4h、6h、8h、10、12h，SDS-PAGE分析表明，4 h诱导培养表达融合蛋白的量就已经很大了 见图4。
2.4.2最适诱导剂浓度的选择：原核表达载体阳性菌落于37℃诱导培养，加入诱导剂IPTG分别至终浓度为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5及2.0 mmol/L，SDS-PAGE分析表明，IPTG终浓度为1.0 mmol/L时，融合蛋白有最大量表达 见图5。
2.4.3最适诱导温度的选择 将阳性菌37℃培养至OD600值达到0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，分别于37℃、28℃诱导培养4h，通过SDS-PAGE分析诱导温度对表达的可溶性蛋白所占比例的影响。结果表明37℃和28℃诱导培养时重组人神经营养素-3融合蛋白都以包涵体形式表达，但28℃培养表达量少于37℃培养，见图6。
3讨论
NT - 3 由Ernfors 等于1990年发现，根据来源及生物活性首先命名为海马源性神经营养因子( hippocumpus derived neu-rot rophic factor ， HDNF)[5]它含有282个氨基酸序列的蛋白质前体。C-端包含了一个可以分离出119个氨基酸的潜在断切位点，在这119个氨基酸中包含6个以二硫键相连的半胱氨酸，这有助于维持NT-3分子的稳定性，这与其生物活性有关。成熟蛋白质后起第9个氨基酸处有一个N-糖化位点[1]，NT-3有长短两种前体，前体蛋白经过蛋白分解产生具有生物学活性、成熟的NT-3。神经营养素-3有2类特异性受体：低亲和力受体p75NTR和高亲和力TrkC受体[6]。
由于NT-3的生理作用，它有可能对周围神经炎、颅脑伤、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、老年痴呆症、神经系统肿瘤等均有治疗作用[6]。
本实验以人胎脑cDNA为模板，采用PCR方法扩增hNT-3基因，并构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3。用SDS-PAGE法测定其在大肠杆菌中的表达，对照载体pGEX-6p-1经诱导培养后表达大小约为26 kD的GST蛋白，成熟的人NT-3蛋白分子量约为13.6 kD，原核表达载体pGEX-6p-1-NT-3诱导后表达的融合蛋白大小约为39.6 kD，与预计结果一致。研究了诱导时间、诱导剂IPTG的浓度及诱导温度对融合蛋白表达的影响，确定最适条件使蛋白质大量表达。hNT-3表达载体的构建及蛋白质的表达为进一步研究奠定了基础。
参考文献
1Patrik Ernfors，Carlos F.IbanezTed，et al.Molecular clonig and neurotrophic activites of a protein with structural similarities to nerve growth factor : development and topographical expression in the brain. Proc Natl Acad Sci USA，1990，87 :5454.
2Maisonpiere P C，Belluscio L. Neurotrophin23 : a neurotrophic gactor related to NGF and BDNG . Science，1990，247 :1446.
3Zhou X F，Robert A. Rush. Location of neurotrophin23 likes imm-munoreactivity in the rat central nevous systerm. Brain Res，1994，643:162.
4Ernfors P. Identification of cells in rat brain and perioheral tissues expressing mRNA for members of the nerve growth factor family. Neuron，1990，5 :511.
5Ernfors P. Molecular cloning and neu-rotrophic activities of a protein with structuralsimilarities to nerve growth factor : Development and topographical expression in the brain . Proc Natl Acad Sci USA， 1990 ，87 : 5454.
6陈旭春，方秀斌.神经营养因子-3的基础与应用研究进展.解剖科学进展，2001，7（3）：257-260.
