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【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定烧伤液中大黄素、大黄素甲醚、槲皮素的含量。方法 采用Hypersil ODS C�18�(4.0 mm×250 mm,5 μm),以甲醇一磷酸盐缓冲液(pH=4)(65:35),流速1.0 ml/ml,检测波长254 nm。结果 大黄素线性范围0.7~7.0 μg/ml,平均回收率98.65%,RSD为1.24%;大黄素甲醚线性范围0.504~5.04 μg/ml,平均回收率为98.70%,RSD为1.08%,槲皮素线性范围0.384~3.84 μg/ml,平均回收率为99.36%,RSD为1.54%。结论 该方法简便、准确,可用于烧伤液的质控。
【关键词】 烧伤液;大黄素;大黄与甲醚;槲皮素;HPLC
Determination of Emodin,Rheochrysidin and Quercetin in Burn tincture hy HPLC
ZHANG Xue-Hua,GUO Li-min,ZHONG Shi-hua,et al.
Pharmacy of Yiyang City Central Hospital in Hunan Province, Yiyang 413000, China
【Abstract】 Objective To establish the HPLC metnod for determination of Emodin, Rheochrysidin and Quercetin in Burn tincture. Methods The Hypersil ODS C�18� was used as the stationary phase. The mobile phase consisted of methanol-phosphate buffer(pH=4)(65:35).The Detecting wavelength was 254nm and flow rate was 1.0 ml/min.Results The linear range of emodin, rheochrysidin and quertetin were 0.7~7.0 μg/ml, 0.504~5.04 μl/ml, 0.384-3.84 μl/ml respectively. The recovery rates of emodin, rheochrysidin and quercetin were 98.65%(RSD=1.24%),98.70%(RSD=1.08%),99.36%(RSD=1.54%) respectively. Conclusion This method is realiable and accurate, the method can be applied to determination of emodin, rheochrysidin and quercetin in Burn tincture.
【Key words】 Burn tincture;Emodin; Rheochrysidin;Quercetin; HPLC
作者单位:413000湖南省益阳市中心医院药剂科(张雪华 郭利民);
湖南师范大学化学化工学院(钟世华 范芳伟)
烧伤液由虎杖、�木叶等中药材提取有效成分而制成,具有清热解毒之功效,用于烧伤患者的创面用药。过去,曾建立了HPLC法同时测定烧伤液中大黄素、大黄素甲醚的含量[1]。为了更好地控制其质量,本文建立了HPLC法同时测定烧伤液中大黄素、大黄素甲醚及槲皮素的含量,取得了满意的效果,为烧伤液质量标准提高提供参考依据。
1 仪器与试药
LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津制作所);SPD-10AVP紫外可见光检测器;C2R6A型数据处理机;大黄素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110756-200110),大黄素甲醚对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110758-200610)。槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100081-200406);烧伤液(本院制剂室自制);甲醇为色谱纯,其他试剂为分析纯;实验用水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱柱 Hypersil ODS C�18�(4.0 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇:磷酸缓冲液(pH=4)(65:35);流速:1.0 ml/min;柱温:30℃;检测波长:254 nm;灵敏度:0.05 AuFS。
2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液的制备 取大黄素、大黄素甲醚、槲皮素对照品适量,精密称定,用甲醇溶解配制成浓度分别为100、72、80 μg/ml储备液,取贮备液进样,得混合对照品色谱图,见图1。
2.2.2 样品溶液的制备 精密量取烧伤液10 ml,置分液漏斗中,加入氯仿液萃取,每次10 ml,共萃取5次,合并氧仿液,置60℃水浴低混蒸干。残渣用甲醇定容至50 ml,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜过滤,取续滤液,得样品溶液,取样品溶液进样,其色谱图见图1。按同法制备不含虎杖、�木叶的阴性样品。结果表明:被测组分色谱峰处无干扰。
图1 HPLC图
A.对照品(1.大黄素2.大黄素甲醚3.槲皮素)B.样品C.阴性样品
2.3 线性关系的考察
依次精密吸取对照品储备液1、2、4、6、8 ml,分别置于10 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成系列质量浓度的混合对照品溶液,分别取上述溶液各20 μl进样分析,以对照品质量浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线并进行回归计算得回归方程:
大黄素:Y=5.463×104X+2.678×102r=0.9998
大黄素甲醚:Y=3.659×104X+1.136×102r=0.9993
槲质素:Y=5.873×104X+0.438×102r=0.9999
结果表明大黄素在0.7～7.0 μg/ml,大黄素甲醚在0.504～5.04 μg/ml,槲皮素在0.384～3.84 μg/ml范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验 取同一对照品溶液,按上述色谱条件,重复进样6次,计算大黄素、大黄素甲醚、槲皮素色谱峰面积的RSD(n=6)分别为1.31%、0.98%、1.47%。
2.5 重复性试验 取同一批号(090311)的样品,按“2.2.2”项下方法平行制备6份样品按上述色谱条件进行分析,计算大黄素、大黄素甲醚、槲皮素含量的RSD分别为1.39%、1.42%、0.98%(n=6)。
2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号090311),室温放置,分别于0、2、4、8、12 h后测定含量,结果大黄素、大黄素甲醚、槲皮素峰面积的RSD分别为0.96%、0.87%、1.13%(n=5)。结果表明样品溶液在12 h内稳定。
2.7 回收率试验 取同一批号(090311)样品溶液10 mL,分别加入一定量的大黄素、大黄素甲醚、槲皮素对照品,按“2.2.2”项下方法操作,分别测定大黄素、大黄素甲醚、槲皮素的含量,计算回收率。结果平均加样回收率及RSD分别为:大黄素98.65%、RSD为1.24%;大黄素甲醚98.70%、RSD为1.08%; 槲皮素99.36%、RSD为1.54%。
2.8 样品含量测定 取3个批号的样品,每个批号取3份,按“2.2.2”项下方法操作,进行含量测定,结果见表1。
表1
含量测定结果(μg/ml)
批号大黄素大黄素甲醚槲皮素
08092234.455.676.60
08121535.125.736.55
09031135.375.816.77
3 讨论
3.1 流动相的选择
由于该方组成复杂,杂质较多,易干扰测定。曾摸索过使用不同的流动相系统[2、3],结果表明本文使用甲醇:磷酸缓冲液(pH=4)(65:35),大黄素、大黄素甲醚、槲皮素等成分均能有效地分离。色谱峰对称性好,分离度高,色谱峰保留时间适中。
3.2 提取方法选择 以萃取的方法,考察两种提取溶剂,结果用氯仿或乙酸乙酯作为提取溶剂对有效成分提取的含量差别不大,但用乙酸乙酯提取所得杂质较多,故选氯仿萃取。
本实验建立了HPLC法同时测定烧伤液中三成分含量的方法,具有方法准确、简便、专属性强,不受烧伤液中辅料的干扰,可用于烧伤液的质控。
参 考 文 献
[1] 易运辉,任志强,龙艾兵.烧伤液中大黄素及大黄素甲醚含量测定方法的研究.中医药学刊,2003,21(8):1330.
[2] 汪霞.反相HPLC法测定黄连上清片中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量.药物分析杂志,2008,28(8):1310.
[3] 张文婷,毕开顺,祝明,等.RP-HPLC同时测定清热明目茶中3个成分的含量.中成药,2008,30(8):1151.
