【www.zhangdahai.com--师德师风建设】
【摘要】 目的:建立人结直肠恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植高转移模型，探讨其生物学特性。方法:采用人原发性结直肠恶性淋巴瘤术中原发灶和肝转移灶新鲜瘤组织块植入裸鼠结直肠粘膜层内，观察原位移植成瘤率，移植瘤的侵袭和转移率，进行形态学（光镜、电镜、免疫组织化学），染色体核型，流式细胞分析。结果:依据新的WHO恶性淋巴瘤的分类法，从4例结直肠淋巴瘤标本中筛选出一株人结肠（非霍奇金B细胞）恶性淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型HCBL-0301和一株人直肠（非霍奇金B细胞）恶性淋巴瘤裸鼠原位移植高转移模型HRBL-0302。移植瘤组织病理学均为非霍奇金（大B细胞性）高度恶性淋巴瘤，免疫组织化学示CD19、CD20、CD22、CD45阳性，CD3、CD7阴性。染色体众数范围55条～69条；流式细胞示DI值1.59～1.71，均为异倍体。HCBL-0301和HRBL-0302分别传至31代和27代，共移植裸鼠326只；自第3代起肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%，HCBL-0301多转移肝右叶，转移率为100%；淋巴结转移率和腹腔种植转移率为67.4%。HRBL-0302多转移左右肝叶，转移率为63.7%，淋巴结转移及腹腔种植转移率56.4%。人结直肠恶性淋巴瘤在裸鼠结直肠内自主侵袭性生长。发生血液转移、淋巴转移和腹腔内种植性转移。结论:HCBL-0301和HRBL-0302是首次建立成功的人结直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植均出现自发性高转移模型。可用于结直肠恶性淋巴瘤的发病机理、侵袭和转移及实验治疗的研究。
【关键词】 结肠肿瘤；直肠肿瘤；淋巴瘤；肿瘤移植；肿瘤转移；疾病模型
【中图分类号】 R735 【文献标识码】 Ｂ 【文章编号】 1007-8231（2011） 07-0297-03
原发性结直肠恶性淋巴瘤临床罕见，占所有原发性结直肠恶性肿瘤的1.2%[1]。病因学和发病机制迄今尚未阐明[2]，手术是原发性结直肠淋巴瘤的主要治疗手段。但是，术后复发和转移是其主要死亡原因[3]。与大肠其他肿瘤相比基础和临床研究的深度和广度仍很受限[4]，缺少可供直接研究的肿瘤组织标本和实验研究的动物模型，建立高转移肿瘤动物模型是研究肿瘤转移生物学行为的前提，使人体外整体实验研究人类恶性肿瘤的自发转移成为可能。这也是在人体外研究进行性肿瘤的实验治疗的关键。为深入探讨结直肠恶性淋巴瘤的生物学行为，我们采用组织学完整的人结直肠恶性淋巴瘤新鲜组织块原位移植裸鼠，首次成功地建立起一株人原发性结肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型和一株人原发性直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植高转移模型，分别命名为HCBL-0301和HRBL-0302。这两株模型完整地重现了人结直肠恶性淋巴瘤的自然临床病理过程，且转移模式与临床病人相似。为结直肠恶性淋巴瘤的基础和临床研究提供了理想的动物模型平台。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物：BALB/C―nu/nu裸小鼠由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院动物室提供。鼠龄3～5周，体重17～20克，雌雄兼用，在SPF（specific-pathogen free）条件下的本院裸鼠室内饲养。
1.1.2标本来源：4例经病理诊断为原发性结直肠恶性淋巴瘤，术中新鲜瘤组织标本由解放军第202医院和辽宁省肿瘤医院提供。
1.2方法
1.2.1标本处理：无菌切取的人结直肠恶性淋巴瘤活体瘤组织置入RPMI-1640培养液中，消除非瘤组织，剪切成1mm3组织小块，供移植用。
1.2.2原位移植与传代[5]：裸鼠在0.5%戊巴比妥钠（30mg/kg）静脉注射全麻下，取腹正中线切口，辨认结直肠，在结直肠的浆膜面向肠壁内做3mm切口深达黏膜层，以0/10无损伤缝合线，经切口将2粒1mm3瘤小块固定于肠壁黏膜层，0/7丝线缝合腹膜，0/5丝线缝皮。术后继续饲养，观察期为60-90天，当荷瘤裸鼠处于濒死状态时，取其中1只荷瘤裸鼠用颈椎脱位术处死，系统解剖，取出移植瘤。一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代，每次传代5～10只不等；另一部分瘤组织液氮冻存备用，进行相关指标检测，其他动物以观察其肿瘤的生长、侵袭和转移。
1.2.3解剖学和组织学检查全部荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查，测量肿瘤体积观察侵袭周围脏器情况；观察结肠上、旁、中间和终末淋巴结、直肠上动脉、肠系膜下动脉、腹主动脉周围淋巴结、肝和脾等各内脏有无肿瘤的转移。移植瘤组织，区域淋巴结和各脏器经10%中性福尔马林固定，石蜡切片，H.E染色，光镜观察。把整个肝脏切开全部包埋于石蜡，于不同平面切片10-20张，并观察肝转移情况。
1.2.4免疫组织化学染色采用LSAB法，对全部裸鼠结直肠肿瘤或有器官转移的切片应用CD3、CD7、CD19、CD20、CD22、CD45抗体进行染色，所用试剂均购自DaKo公司。
1.2.5电镜观察移植瘤组织以2.5%戊二醛和1%锇酸双固定，Epon-812包埋，超薄切片，铀-铅染色，PHILIPS-CM10透射电镜观察。
1.2.6流式细胞分析[6]采用美国FACS-420型流式细胞仪，对正常结直肠黏膜细胞、移植瘤细胞进行DNA含量测定。
1.2.7染色体检查采用短期培养，不加有丝分裂刺激方法，收获细胞常规制片，GTG法染色,显微镜下观察[5]。
1.2.8结直肠恶性淋巴瘤组织学分类标准：采用2001年新的WHO分类方法[7]。
1.2.9统计学处理差异显著性检验采用t检验，数据以 ±s表示，在SPSS10.0统计软件上完成。
2结果
2.1HCBL―0301与HRBL-0302的建立
HCBL―0301模型瘤源标本取自1位59岁男性手术切除的右半结肠恶性淋巴瘤原发灶和肝转移灶新鲜组织块（病理诊断：原发性结肠非霍奇金B细胞高度恶性淋巴瘤，伴肝转移），分别各移植裸鼠3只、6只裸鼠均获首代移植成功。目前已传至31代，共移植裸鼠193只，平均潜伏期为7.6天，传代间期为27.4天，肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成瘤均为100%。尸解发现：结肠壁可见许多圆形或不规则形的斑块状浸润病灶，直径为0.3mm×0.5mm至0.6mm×0.9mm。粘膜皱襞消失，表面见有溃疡形成。切面，整个肠壁增厚，肿瘤细胞主要侵袭粘膜下层，有的区域肌层和浆膜层亦被浸润破坏。可见肠穿孔，肿瘤呈灰白色。经病理切片检查：193只裸鼠结肠均见淋巴瘤细胞侵袭生长。125只结肠上、旁、中间淋巴结转移（64.77%），肝转移灶移植的裸鼠多伴有广泛腹腔播散种植转移，193只发生肝转移（100%）可见肝转移主瘤周围卫星结节和全肝的播散。移植后的26天荷瘤裸鼠开始消瘦，43天明显衰竭，腹部彭隆，因衰竭濒临死亡，荷瘤裸鼠最长生存期为62天。
HRBL―0302 模型瘤源标本取自1位43岁男性手术切除直肠恶性淋巴瘤原发灶新鲜组织块，（病理诊断：原发性直肠非霍其金B细胞高度恶性淋巴瘤）移植裸鼠6只，4只获得移植成功。首代移植成功率为66.7%。目前已传至27代，共移植裸鼠133只。平均潜伏期为6.4天，传代间期24.7天。从第3代起传代肿瘤成瘤率和液氮冻存复苏成活率均为100%。尸解发现：肿瘤弥漫侵袭直肠壁全层，整个肠壁浸润肥厚，可见许多圆形或不规则形的斑块状浸润病灶，粘膜皱襞完全消失，整个肠壁显著增厚，切面灰白色， 均质状。表面见数个圆形、卵圆形或不规则多发性溃疡，大小0.7mm×0.5mm至0.4mm×0.3mm不等。边缘隆起，底部不平，经病理切片检查：127只裸鼠直肠均见淋巴瘤细胞弥漫侵袭生长，85只（63.7%）发生肝转移，75只（56.4%）发生直肠旁，直肠上动脉，肠系膜和腹股沟淋巴结转移和腹腔种植转移。原位移植后的23天荷瘤裸鼠开始消瘦，37天明显衰竭，腹部彭隆，因衰竭濒临死亡，荷瘤裸鼠最长生存期为67天。
2.2HCBL-0301和 HRBL-0302模型的侵袭和转移
2.2.1淋巴结转移：局限于腹腔，结肠上、旁、中间和终末淋巴结，直肠旁、上动脉、肠系膜和腹股沟淋巴结，少数动物有肝门淋巴结转移。依受累程度，淋巴结转移分为三期：①早期：只在输入淋巴管和边缘窦内出现瘤细胞团；②中期：瘤细胞进一步向副皮质和髓质内侵袭性生长；③晚期：除在边缘部分残存少量淋巴结组织外，整个淋巴结几乎为瘤细胞侵占。
2.2.2肝转移：出现在原位移植第3周末，HCBL-0301模型肝转移，多局限在肝右叶，呈结节巨块形，在其周围有小瘤块散在。HRBL-0302模型肝转移呈弥漫型，瘤灶可散布在肝左、右叶甚至全肝，呈大小不一，数目不等圆形或椭圆形灰白色的瘤结节。瘤灶位于肝实质内。转移灶小至血管内瘤栓；大至肉眼可见直径为0.3mm×0.4mm和0.7mm×0.9mm。最大直径为1.5cm×2.5cm，镜下见转移瘤细胞呈侵袭性生长。严重时肝组织由瘤结节替代。
2.2.3腹腔种植转移见于腹腔脏层、壁层腹膜及网膜、胃壁、肠壁、肠系膜种植的灰白色瘤结节。有的裸鼠可见广泛腹腔种植的全腹腔癌病。
2.3移植瘤的形态学特征
2.3.1HCBL-0301光镜下瘤细胞弥漫分布，核大浓染，呈圆形、卵圆形和肾形，可见核仁，胞浆少，肠粘膜腺体被瘤细胞分隔，萎缩减少。结肠全层被无数瘤细胞浸润。电镜下瘤细胞核大，不规则，核圆形或椭圆形；异染色质沿核膜分布，呈条块状，核仁小，靠近核膜；胞质少，见少数肿胀变空线粒体及少量长的粗面内质网。
2.3.2HRBL-0302光镜下弥漫侵袭肠壁全层及粘膜表面，细胞大，卵圆形或多角形，胞浆少，可见多核瘤巨细胞，核大，呈圆形或不规则形，核染色质不均匀，可见核仁，病理核分裂相多见。电镜下瘤细胞核大。核多形性，有的核有1-2条不规则深沟及不对称分叶，呈多叶核。少数核呈圆形或卵圆形，异染色质沿核膜聚集，核仁大小不一。胞质少，有少量肿胀线粒体及扩张粗面内质网。
2.4免疫组织化学检查
HCBL-0301模型和HRBL-0302模型移植瘤细胞对CD19、CD20、CD45均呈阳性表达，对CD3、CD7 均呈阴性表达。
2.5瘤细胞DNA含量分析
HCBL-0301模型和HRBL-0302模型原位移植瘤细胞FCM检测均示异倍体，结果见表1。
表1HCBL-0301和HRBL-0302移植瘤FCM DNA检测结果（±s）
Table 1. DNA detection of transplanted tumors from HCBL-0301 and HRBL-0302 by flow cytometry （±s）
注：与结直肠正常细胞比较*P [3] Villanueva-Saenz E,Alarez-Tostado Fernandez JF,et al.Colonic primary lymphma.Rev Gastroenterl Mex.2002 Jan-Mar;67(1):28-33.
[4] Iarumov N,Terziev I,Gachev N,et al.surgical treatment of complicated gastrointestinal forms of non-Hodgkin lymphomas.Khirurgiia(Sofiia).2002;58(2):7-9.
[5] 脱帅，刘秋珍，张宁，人小肠原发性恶性淋巴瘤裸小鼠高转移模型的建立.解放军医学杂志，2004,29(5):409-412.
[6] Krugmann J,Gschwendtner A,Mairinger T,et al.DNA Ploidy in Gastrointestinal B-cell Lymphomas:An Image Analysis Study of 43 Cases.Analyt Quant Cytol Histol 2003;25(1):31-38.
[7] Baschinsky DY. Weidner N. Backer PB.et al. Primary hepatic anaplastic Iargercell lymphoma of T-cell phenotype in acquired immumodeficiency syndrome: a report of an autopsy case and review of the literature.AM J Castroenterol,2001.96(1):227-232.
[8] Luzzi KJ,MacDonald IC,Schmidt EC,et al. Multistep nature of metastatic inefficiency:dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.Am Jpathol,1998,153:865-873.
基金项目
国家重点科技攻关计划基金资助项目（编号96A230603）,辽宁省自然科学基金（编号20042153）。
