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[摘要] 目的：观察益脑胶囊对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中细胞间黏附分子-1（ICAM-１）表达及其影响。方法：用45只Wistar大鼠，随机分为假手术组、模型组、益脑胶囊组，利用线栓法制作大脑中动脉缺血-再灌注模型。使用神经功能评分NSS标准进行评分；免疫组化染色观察再灌注后不同时间点细胞间黏附分子ICAM-1的表达。比较不同实验组相同灌注时间点ICAM-1表达的变化及神经功能改变。结果：局灶性脑缺血再灌注后，相同时间点模型组的神经功能评分和ICAM-1表达均较假手术组升高，治疗组均低于模型组。结论：益脑胶囊通过降低ICAM-1在缺血区的表达，抑制炎症反应，达到健脑益智之功效。
[关键词] 益脑胶囊；缺血-再灌注；细胞间黏附分子-1
[中图分类号] R-33[文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2011）01（b）-009－０3
Effect of Yinao Capsules on the activation of ICAM-1 and the expression of inflammatory cytokine in the cerebral cortex during focal cerebral ischemia in rats
LI Donghong, MA Fengjie, ZHANG Lei, SUN Xiaopeng, DONG Bing
(Neurology Staff Room, Weifang Medical College, Shandong Province, Weifang261042,China)
[Abstract] Objective: To investigate the effect of Yinao Capsules on the activation and the expression of ICAM-1 in cerebral cortex during focal cerebral ischemia in rats. Methods: Forty-five Wistar rats were randomly divided into 3 equal groups: sham operation group, ischemia/reperfusion group, Yinao Capsules group undergoing intragastric administration two weeks before ischemia/reperfusion, the animal models of the MCA ischemia/reperfusion was established in Wistar rats. For every successful model, the neurologic impairment score was run by the Neurological Seerity Scores(NSS); the expression of ICAM-1 at different times after reperfusion was measured by immunohistochemistry. Then compare the change of neural function and the expression of ICAM-1 at different groups in the same time. Results: The expression values of ICAM-1 and NSS in the ischemic group weresignificantly higher than those in the sham operation group, Yinao Capsules group were all significantly lower than those in the ischemic group. Conclusion: Yinao Capsules inhibits the inflammatory reaction by inhibiting the ICAM-1 expression during ischemic region to achieve neuroprotective effect.
[Key words] Yinao Capsules; Ischemia/reperfusion; ICAM-1
缺血性脑血管病给患者带来严重的损伤，其中炎症级联反应是造成损伤机制中重要的一方面，因此减轻炎症反应对脑保护作用尤其重要。现已明确，炎症级联反应中细胞间黏附分子起着主要作用。因此如果某种药物可以通过影响细胞间黏附分子的表达而减轻炎症反应，则对缺血性脑血管病有重要的意义。近几年中药制剂越来越受到人们的重视，并已广泛应用于临床，取得了较好的效果。益脑胶囊为纯中药制剂，有健脑益智，益气健脾，滋肾养肝，通窍醒脑之功，但其对缺血性脑损伤的保护作用及是否对脑缺血再灌注后炎症反应起抑制作用尚未有报道。本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，通过神经功能评分及免疫组化染色，来观察益脑胶囊是否通过抑制炎症反应来发挥神经保护作用。
1 资料与方法
1.1 药品与试剂
细胞间黏附分子-1（ICAM-1）免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；益脑胶囊（福州闽海药业）。
1.2 方法
1.2.1 动物
Wistar大鼠45只，体重180~220 g，由潍坊医学院动物中心提供，随机分组。
1.2.2分组及处理
动物随机分为3组：假手术组、模型组、益脑胶囊治疗组。药物组按照脑缺血再灌注2、12、24 h分为3个亚组。灌胃给药，每天1次，连续2周，模型组给予等量0.9%NaCl溶液，余相同。
1.2.3 模型制作
1.2.3.1 假手术组：颈部正中切口暴露右侧颈总动脉缝合皮肤。
1.2.3.2 模型组：模型制作参照改良的Longa-Zea氏线栓法[1]，大鼠用10％水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉大鼠仰卧固定于手术木板上，颈部正中切口，从两侧颌下腺之间剪开浅筋膜，显露右侧胸锁乳突肌。钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露颈总动脉（CCA）。分离颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA），在ECA近心端穿手术线，结扎CCA近心端及ECA近心端，并用无创动脉夹夹住ICA近心端，在CCA靠近动脉分叉处穿一手术线打一松结，以防插鱼线时切口处渗血，在CCA距动脉分叉处0.5 mm处剪一小口，经此小口插入备好的栓线，经ICA （松开此处动脉夹）入颅至大脑前动脉（ACA）以阻断MCA的血流（向内上方的角度插入，以防进入翼鄂动脉）[2]。尼龙丝平均插入深度为19～22 cm[3]，结扎ICA以固定尼龙丝和防止出血，缝合皮肤。栓塞2 h后麻醉拔出栓线实现再灌注，分别于再灌注后2、12、24 h处死动物。大鼠苏醒后出现手术同侧Horner征和对侧肢体活动障碍为模型成功。
1.2.4 观察指标
1.2.4.1 神经功能评分（NSS）：每组大鼠分别于再灌注后2、12、24 h进行神经功能评分，最高18分，最低0分。
1.2.4.2 免疫组化测定ICAM-1表达：到预定时间，大鼠用0.9%NaCl溶液和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。经尾壳核水平行冠状切片（脑片厚度约15 mm，共A、B、C、D、E 5个脑片），固定、脱水、包埋成蜡块，连续切片，连取5张作免疫组化染色，按照试剂盒说明书用SP法进行ICAM-1免疫组化染色，阳性细胞为胞浆棕黄色颗粒。阴性对照以PBS代替一抗，其余步骤同上。每张切片在10×40倍显微镜下随机选取缺血区内的4个视野，进行ICAM-1阳性细胞的计数。
1.3 统计学分析
数据采用x±s表示，应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。组间差异采用单因素方差分析，以α=0.05作为显著性检验标准。
2 结果
2.1 神经功能评分
假手术组手术后无神经功能缺损体征出现，神经功能缺损评分为0分。模型组与治疗组均有不同程度的神经功能缺损，治疗组神经功能有所改善（P�0.05），且再灌注24 h改善最明显（P�0.01）。数据见表1。
2.2 ICAM-1的表达
在假手术组ICAM-1呈少量低表达，缺血灶大脑皮质内有明显表达（图1）。模型组较假手术组表达均增高（P�0.01），且呈逐渐增高的趋势（图2、3、4）。治疗组相同时间点表达均低于模型组，且再灌注12、24 h降低更明显（图5、6、7）。数据见表2。
同一时间点与假手术组比较，*P�0.01；与模型组比较，△P�0.05，△△P�0.01
3 讨论
近年来黏附分子在脑缺血再灌注损伤中作用的研究已成为研究的热点之一。在正常情况下，血管内皮细胞上仅有少量ICAM-1表达，脑缺血时，在TNF-α、IL-1和INF等共同作用下，ICAM-1在血管内皮细胞的表达明显上调，介导中性粒细胞黏附，在脑缺血再灌注损失中起重要作用[4]。黏附分子在脑缺血后的作用已在实验性持久性或短暂性局灶脑缺血动物模型中得到证实。在20世纪90年代，有许多关于动物脑缺血或再灌注后在缺血区域黏附分子表达升高的报道，比如ICAM-1等[5]。抗黏附分子实验研究证实，针对ICAM-1、P-选择素等的单克隆抗体可以减轻脑或脊髓的缺血损害，有神经保护作用，并且对神经的保护作用在短暂缺血然后进行再灌注后较明显，而在永久缺血模型中不明显[6]。本研究结果显示，脑缺血再灌注2 h后ICAM-1的表达开始升高，并于24 h达到峰值。应用益脑胶囊后能明显下调ICAM-1的表达，且能够改善神经功能，提示益脑胶囊可能通过降低ICAM-1的表达抑制炎症反应，发挥脑保护作用。
益脑胶囊为纯中药制剂，主要由鹿茸、人参、党参、灵芝、茯苓、龟甲胶、麦冬、五味子、石菖蒲、龙骨、远志等组成，有健脑益智，益气健脾，滋肾养肝，通窍醒脑之功。其中鹿茸已经被动物试验证明可抑制各种急慢性炎症，保护细胞质膜的完整性及改善线粒体、内质网等细胞器的损伤[7]。更有研究表明鹿茸多肽具有促进神经再生、加快神经轴突生长速度，有助于功能恢复的作用[8]。党参水提物通过提高机体免疫功能，清除衰老机体产生过多的自由基，抗脂质过氧化而起到延缓衰老的作用[9]。人参中含有的主要有效成分人参皂苷同时具有保护脑细胞免受缺血再灌注损伤及抗缺氧等作用[10]。近几年来实验已经证明益脑胶囊具有抗衰老、改善学习记忆等功效[11]。本实验结果显示益脑胶囊可抑制脑缺血再灌注后ICAM-1的表达，进而抑制炎症反应，减轻缺血再灌注后损伤，这可能是益脑胶囊的脑保护作用机制之一。
[参考文献]
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（收稿日期：2010-12-07）
