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[摘要] 目的：探究白花蛇舌草对宫颈癌的抑制作用及可能的分子生物学机制。方法：建立裸鼠人宫颈癌细胞移植模型及采用胃内灌药。当肿瘤生长至直径10 mm时，将荷瘤鼠随机分组，比较给药组与对照组在抑瘤率、生存时间、HeLa细胞Ki-67抗原蛋白的表达率以及肿瘤组织凋亡上的差异。结果：白花蛇舌草对HeLa细胞移植瘤生长有明显抑制作用，并可诱导HeLa细胞凋亡，Ki-67蛋白的表达下降(P 1.3 实验方法
1.3.1 裸鼠宫颈癌移植模型的建立
裸鼠40只，雌性，4~6周龄，体重18~20 g，购于中国科学院上海实验动物中心。裸鼠饲养于恒温(22~25℃)、恒定湿度的SPF（specific pathogen free condition）层流罩中。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。培养的HeLa细胞经胰酶消化后离心，用PBS液清洗2次；将细胞团块吹散，经台盼蓝实验证实细胞活力大于95%；取HeLa细胞2×106个(0.2 ml) 接种于裸鼠背部皮下组织内，动物继续饲养于层流罩内，观察2周，成瘤率为100%。
1.3.2实验动物分组与给药
当肿瘤生长至直径10 mm时开始实验，将荷瘤鼠随机分为两大组，每组20只小鼠，再随机分成两个小组，分别用于观察抑瘤率和生存时间。①对照组：荷瘤鼠不加以治疗，继续饲养至实验结束（n=10）；②白花蛇舌草组（实验组）：白花蛇舌草水煎液灌胃，以5.0 ml/（kg・次・只）给药，1次/d，共10次（n=10）。白花蛇舌草灌胃水煎液制备：白花蛇舌草300 g加水3 000 ml，温火煎煮2 h，去渣浓缩为300 ml备用。
1.3.3观察指标和检测
1.3.3.1抑瘤率观察荷瘤对照组裸鼠（n=10）不加以治疗，继续饲养至实验10 d。给药组（n=10）：白花蛇舌草水煎液灌胃，每天1次，第10天停止给药，次日采用颈椎脱臼法杀死小鼠后，在无菌条件下取出小鼠肿瘤分别称重，计算抑瘤率。抑瘤率=（C�T）/C×100%。其中T为实验组平均瘤重，C为对照组平均瘤重，称重后组织常规固定进行病理检查。
1.3.3.2生存时间观察对照组和白花蛇舌草组（n=10），喂养动物直至死亡，计算荷瘤小鼠的平均生存时间。
1.3.3.3小鼠宫颈癌肿瘤组织Ki-67蛋白表达免疫组化检测将裸鼠肿瘤组织石蜡包埋切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，接着浸入配制好的柠檬酸/柠檬酸钠中，95℃水浴10 min，后用0.3% H2O2室温作用30 min，消除内源性辣根过氧化物酶活性。PBS洗后用血清封闭，室温1 h后PBS洗1遍，上一抗（Ki-67抗体，1∶100）4℃ 48 h。48 h后吸去一抗，PBS洗3遍，以后的操作按Vect ABC试剂盒进行，即生物素标记的二抗4℃过夜，PBS洗3遍，辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素卵白素复合物，37℃ 1 h。PBS洗4遍，最后DAB显色，镜检控制结果。然后梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。
每批染色均设阳性对照与阴性对照，用已知阳性片作阳性对照，对照实验为以磷酸缓冲液(PBS)代替一抗，其余操作相同。
1.3.3.4小鼠宫颈癌肿瘤组织凋亡检测（TUNEL法）采用ApopTagR Peroxidase In Situ Apoptosis Detection 试剂盒，按说明书操作行TUNEL染色。石蜡包埋切片（5 mm），常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蛋白酶K20 μg/ml室温消化20 min, 在TdT酶和核苷酸混合液中孵育37℃ 1 h，用stop/wash buffer 停止反应，在anti-digoxigenin conjugate室温孵30 min，最后DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。凋亡细胞核呈现棕黄色。
1.4统计学方法
实验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验或方差分析，以SPSS 14.0软件处理。
2结果
2.1白花蛇舌草对HeLa细胞荷瘤小鼠抑瘤率的影响
用白花蛇舌草水煎液灌胃，可明显抑制宫颈癌HeLa细胞肿瘤的生长，未经治疗的对照组的平均瘤重为（1.61±0.30） g，而经白花蛇舌草治疗的HeLa细胞荷瘤小鼠平均瘤重为（1.03±0.26） g，抑瘤率为36.1%，实验组瘤体减小与对照组比较，差异有统计学意义(P75%为(++++)。阳性细胞反应定位于细胞核，多呈黄色和棕黄色颗粒，对照组Ki-67的表达率仅为21.2%，而白花蛇舌草治疗组的Ki-67的表达率为72％，两者相比，P 随着对祖国医学的研究不断深入，中医药在宫颈癌临床治疗中的效果越来越受到关注。在植物中寻找有效而副作用小的抗肿瘤药物已成为国内外重要的课题，关于中药抗肿瘤机制的研究方兴未艾。在中晚期宫颈癌的治疗中可合并中医药治疗，以起到增效减毒的作用。对于转移范围广，身体功能弱，已经难以耐受化疗的中晚期宫颈癌患者，可用中医药进行保守治疗，增强机体的免疫功能，提高对肿瘤的抵抗能力。虽然短期效果没有化疗明显，但远期效果好，在改善生存质量，延长生存期方面效果明显。
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willdl)为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草的全草。在中国主要分布于南方各省区，夏秋季节采收，洗净，鲜用或晒干。其味微苦、微甘，性凉，入心、肝、肺经，具有清热、解毒、利湿、抗癌等功效。近年来许多学者对白花蛇舌草进行了广泛的研究，特别是对其化学成分、药理作用和临床应用等方面的研究更为深入，揭示白花蛇舌草具有广泛的药理活性，其中增强免疫功能与抗肿瘤活性引起许多学者和临床医生的极大关注。作为癌症的辅助治疗有较好的疗效，已被用来临床治疗各类肿瘤：如原发性支气管癌、肺癌、直肠癌、鼻咽癌、肝癌、食管癌、淋巴癌、卵巢子宫内膜样癌、胃癌等[2]。在体外实验的研究中也显示白花蛇舌草对多种肿瘤细胞株具有增殖抑制作用[3-4]。如李雨成等[5]发现白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞的增殖有显著的抑制作用,且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。李洁等[6]研究表明白花蛇舌草能有效地抑制肝癌H22肿瘤的生长,并能显著加强化疗药DDP 的抑瘤效果。尽管现代研究已经证明白花蛇舌草对肿瘤细胞有肯定的抑制作用。但具体的抗肿瘤机制尚不明了。
本课题观察了白花蛇舌草提取物对宫颈癌HeLa细胞荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用，并通过观察白花蛇舌草对肿瘤组织细胞增殖相关基因Ki-67表达的抑制情况，探讨和分析白花蛇舌草抗肿瘤的具体机制，从而为白花蛇舌草的临床应用和抗肿瘤新药的开发和研制提供依据。
在动物实验中，用白花蛇舌草水煎液灌胃，可明显抑制宫颈癌HeLa细胞肿瘤的生长，未经治疗的对照组的平均瘤重明显低于给药组，抑瘤率为36.1%。未经白花蛇舌草处理的对照组小鼠的肿瘤组织无明显变化，而在经白花蛇舌草处理的实验组肿瘤瘤块内出现大面积的细胞坏死，坏死细胞结构不清、核深染、同时可见变小凋亡细胞以及核固缩等细胞凋亡征象。白花蛇舌草实验组宫颈癌肿瘤细胞凋亡率明显高于对照组。未经白花蛇舌草治疗的对照组的平均生存时间明显缩短，实验组生存时间延长率为46.6%。
以往的研究表明，子宫颈癌的发生是多因素协同作用的结果，组织学改变是由鳞状上皮单纯性增生、不典型增生、原位癌到浸润性癌的渐进性癌变过程。现已知HPV属乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，其致癌作用与HPV-DNA的整合有关。HPV感染宿主细胞后，首先潜伏在黏膜表面的基底层细胞，在棘层细胞和颗粒层的分化角质细胞中复制，病毒核酸整合到宿主细胞内，使宿主细胞发生突变，整合后的DNA发生致癌作用的主要基因为E6、E7和E2，其中E6和E7干扰细胞增殖周期，使细胞无限增殖，这是目前认为HPV导致子宫颈癌发生的分子学基础。研究同时发现HPV的感染和Ki-67抗原的表达具有明显的相关性[7-9], 表明宫颈癌的发生与细胞增殖有关。这对我们研究和治疗宫颈癌找到了一个突破口，如果能抑制Ki-67的表达，就能抑制宫颈癌细胞的增殖，最终达到癌细胞凋亡的目的。Ki-67基因是一细胞增殖相关基因，所编码的Ki-67蛋白是肿瘤细胞增殖所必需的DNA结合蛋白，其在G1中晚期出现，经S、G2期在M期达到高峰，M期后即快速降解。Ki-67抗原是一种贯穿表达于增殖期细胞中的核抗原[10]。Ki-67高增殖指数与许多肿瘤(乳腺癌、淋巴瘤、内分泌肿瘤等)的分化程度、浸润转移及预后有关，是恶性肿瘤预后的参考指标之一[11]。曾永群等[12]研究结果显示宫颈腺癌Ki-67 高表达占59.3%、中表达占7.4%、低表达占33.3% ,腺体增生组则无一例表达，提示Ki-67高表达可作为恶性病变的佐证,有助于鉴别异型性不明显的高分化腺癌。
笔者采用RT-PCR检测Ki-67 mRNA表达，发现不同剂量的白花蛇舌草药物血清对宫颈癌HeLa细胞的Ki-67 mRNA表达与对照组有明显的抑制作用。实验组随着白花蛇舌草药物浓度的增加以及作用时间的延长，HeLa细胞Ki-67 mRNA表达率逐渐降低，而对照组随着时间的延长，Ki-67 mRNA的表达无明显变化。结果表明白花蛇舌草对HeLa细胞Ki-67 mRNA的表达有着一定的量效关系，随着剂量的增加，药物作用时间的延长，Ki-67 mRNA表达有明显的下降。
同时，笔者用细胞免疫组化检测的方法，发现不同剂量的白花蛇舌草药物血清对宫颈癌HeLa细胞Ki-67抗原的表达有明显的抑制作用。实验组随着白花蛇舌草药物浓度的增加以及作用时间的延长，HeLa细胞Ki-67蛋白的表达率逐渐降低，而对照组随着时间的延长，Ki-67蛋白的表达无明显变化。结果表明白花蛇舌草对HeLa细胞Ki-67蛋白的表达同样存在着一定的量效关系。
本研究显示白花蛇舌草含药血清对宫颈癌HeLa细胞的增殖起到明显的抑制作用(P
