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摘要： [目的] 研究双酚Ａ对硬骨鱼生殖腺性分化的影响并探索其作用机制。 [方法] 运用日本比目鱼的温度决定性别的生物学特性，在鱼卵孵化后的第30天到第100天性分化敏感期内， 利用27℃水温使幼鱼都分化成表型的雄性，从第30天开始，给予幼鱼双酚A 100μg/g的饲料。在第100天青年期和第300天成年期，分别对各组比目鱼样本做病理组织切片，判断其性别和雌雄比例，通过原位杂交分析以及RT－PCR分析，探索它们的作用机制。 [结果] 双酚Ａ对27℃水温饲养下的雄性比目鱼幼鱼都有雌性化诱导作用，100μg/g组成年雌性比例占57%，显著高于27℃对照组（0%）；比目鱼幼鱼出生后第100天时，原位杂交分析显示，芳香化酶P450的mRNA在双酚Ａ组的雌鱼卵巢中，有明显表达，但在雄鱼精巢中不表达；而MIS（苗勒氏管抑制物质）的mRNA在双酚Ａ组的雌鱼卵巢中不表达，却在雄鱼精巢中能见到极其明显的表达。RT－PCR实验也证实了原位杂交的结果。 [结论] 双酚A对日本比目鱼的生殖腺性分化有雌激素样的作用，雌性化作用的机制很可能是诱导了芳香化酶P450的mRNA表达而且抑制了MIS的mRNA表达。此实验研究也为预防相关疾病和保护公众健康提供依据。
关键词： 日本比目鱼； 性分化； 双酚A； 芳香化酶P450
中图分类号：R136.3+1文献标识码： Ａ
双酚A(Bisphenol A,BPA)是苯酚和丙酮的衍生物，它是一种重要的有机化工原料，作为单体物质用来生产聚碳酸酯等高分子材料和塑料剂，应用于食品包装材料、牙科密封剂、婴儿奶瓶等塑料制品[1],再释放进入环境。近年来BPA被认为是一种外源性雌激素，进入体内后能干扰正常激素分泌而影响生殖系统分化和发育[2]，危害公众的健康。但它的雌激素样作用的分子机制仍未完全定论。日本比目鱼是一种生活在日本海水中常见的硬骨鱼，对环境因素非常敏感。它具有XX(雌性)/XY(雄性)性别决定机制[3]。研究表明，基因型雌鱼在性分化时期，如果喂养于18℃低水温下，它们仍然会发育成表型雌鱼。但如果幼鱼性分化时期被喂养在27℃高水温条件下或雄激素喂食下，基因型雌鱼的性别可以被完全转化而发育成为表型的雄鱼[4]。因此，日本比目鱼为研究环境因子对性分化作用的分子机制提供了一个极好的动物模型。为了解释双酚A这类雌激素样化学物对日本比目鱼的生殖腺性分化的作用机制，为预防相关疾病提供依据，我们在27℃高水温下对比目鱼幼鱼喂食BPA，并用雌二醇（17β-estradiol,E2）作为阳性对照，检测鱼类性别的变化以及生殖腺内性别相关基因的表达水平。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
仪器有高速冷冻小型离心机MX100(TOMY，Japan)；PCR仪（ASTEC,Japan）；培养箱 (ADVANTEC CI410,Japan)；蒸汽高温灭菌仪：高压蒸汽消毒仪BS245(TOMY,Japan)；显微镜（OLYMPUS）。双酚A，购自Wako（日本）公司。
1.2 实验动物
实验中所有雌性日本比目鱼都由人工交配方式，使遗传学雌性和表型雄性交配得来[４]。
幼鱼孵化后饲养在18?C较低水温中直到染毒开始时为止。
1.3 方法
1.3.1 实验染毒 BPA染毒方法是按BPA 100μg/g饲料的比例拌入人工饲料，在27℃高水温下在幼鱼性分化时期喂食幼鱼，即从鱼卵孵化后第30天到第100天。另设18℃普通水温对照组、27℃高水温对照组和雌二醇（E2，1μg/g）阳性对照组。
1.3.2 组织学观察 表型性别的决定是通过第100天（青年期）和第300天（成年期）的比目鱼生殖腺的组织学切片观察来判断的[５]。成年鱼的生殖腺和第100天的小鱼被固定于Bouin"s溶液里，冷藏于4℃过夜，用不同浓度乙醇逐级脱水，包埋于石蜡中，连续切片，每片厚5μm，最后用苏木精－曙红（H.E.）染色。
1.3.3 原位杂交分析 在RNA酶灭活条件下，将第100天的青年期小鱼固定于Bouin"s溶液中，4℃放置过夜，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，厚5μm。将组织切片脱石蜡，再加水之后，用1μg/ml的蛋白酶K磷酸缓冲液（PBS）处理5min，室温下，此反应被加入的2mg/ml氨基乙酸终止5min。组织玻片在PBS中漂洗2次后，用4％多聚甲醛PBS溶液固定10min，再于PBS中漂洗二次后，组织切片与1μg/mlDIG标记的反义RNA探针杂交，此探针由TA载体pCR II转录而来，包含日本比目鱼P450arom和MIS的cDNA[6]。在DIG Easy Hyb溶液中于55?C过夜。杂交后的组织切片在50％甲酰胺溶液中漂洗二次，每次30min。再用1μg/ml（P450arom）或10μg/ml（MIS）的RNase A 于37?C下反应30min，应用碱性磷酸酶共轭的抗DIG抗体和NBT/BCIP的免疫反应，使用DIG核酸检测试剂盒（罗氏公司）来测试DIG信号。
1.3.4 逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）分析 总RNA的提取：所有步骤均在RNase灭活条件下进行。总RNA是通过ISOGEN从第100天的青年期比目鱼的生殖腺中提取的。生殖腺在100μl ISOGEN中被均质化，在均质液中加入20μl氯仿，螺旋振荡5秒，15000转/分离心15min，移去上清液，转入新离心管内，加40μl异丙醇，15000转/分离心30min。移去上清液后，总RNA沉淀用70％乙醇洗涤，空气中干燥后溶于DEPC处理过的水中。
逆转录（RT）反应：RT反应使用RNA PCR试剂盒和温度循环仪完成。第一链cDNA合成于总RNA，总RNA在65℃中变性10min，于42℃下在RT混合液中共同培养30min，再于99℃ 5min。
聚合酶链反应（PCR）：PCR反应使用基因特异性引物对P450arom、MIS和延长因子（EF－1α），使用转录产物cDNA作为PCR混合液中的模板。PCR条件是：95℃预热10min，94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1min，末次延伸于72℃ 5min。PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭溶液染色，紫外灯下观察条带。
基因引物对（5"-3"）扩增长度循环数P450arom5"-ATC GGA TCC CTG CCT GTG AC-3",5"-TGGCTG ATG CTC TGC TGA GG-3"344 bp30MIS5"-TGA CCC GTA CCT ACG AGC TG-3", 5"-TCG TCC ACG TTC TCG CTC TC-3"291bp25EF-1a5"-AGT TCG AGA AAG AAG CTG CC-3",5"-ATC CAG AGC ATC CAG CAG TG-3"577 bp25
2 结果
2.1 BPA染毒对遗传学雌性比目鱼组性别比例的影响
从图1和图2（见封3）中可以看出，当遗传学雌性幼鱼给予正常食料喂养并控温在18℃普通水温时，组织学检查发现生殖腺分化为椭圆的卵巢，且见到了卵巢腔，说明几乎所有幼鱼都发育成正常雌鱼（雌性占96.3％）。然而，当幼鱼被喂养在27℃高水温时，它们组几乎都发育成表现型的雄鱼（雌性占0％），可见到生殖腺发育成狭长的精巢，没有卵巢腔。与此对应， E2阳性对照组和BPA组在27℃下染毒后，幼鱼被全部和部分诱导为雌性，E2组雌性占100％，BPA组雌性占57.1％，组织学检查中也没有发现卵巢－精巢同体的比目鱼。这些结果说明BPA对于日本比目鱼的生殖腺性分化过程具有雌激素样干扰作用。
图1 BPA对日本比目鱼性别比例的影响
每条鱼的性别判定依据于成年期生殖腺形态学和组织学观察检测。18℃对照,n=27; 27℃对照,n=40;
E2,1μg/g食料, n=23;
BPA,100μg/g食料, n=21
2.2 原位杂交分析各组生殖腺中P450arom mRNA的表达
图3（见封3）和表1显示原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom mRNA的表达。在18℃对照组（图3a）、E2组（图3c）和BPA组（图3d）的雌性生殖腺中P450arom mRNA有显著表达；然而在27℃模型组（图3b）的雄性生殖腺中没有表达。
2.3 原位杂交分析各组生殖腺中MIS mRNA的表达
图4（见封底）和表2显示原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中MIS
mRNA的表达。在18?C对照组（图4a）、E2组（图4c）和BPA组（图4d）的雌性生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；然而在27℃模型组（图4b）的雄性生殖腺中有极其明显的表达。
2.4 RT-PCR分析各组生殖腺中P450arom和MIS mRNA的表达。
表2组织学和原位杂交分析青年期生殖腺的小结
组别卵巢腔P450arom mRNA
表达的强弱MIS mRNA
表达的强弱18℃对照有+-27℃对照无-+++27℃+E2有+-27℃+BPA有+-表达位置基质细胞支持细胞
图5（见封底）显示RT-PCT分析每组各3条比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom 和MIS mRNA的表达，也进一步验证原位杂交获得的结果。在18℃对照组全部雌鱼和BPA组一条雌鱼的生殖腺中P450arom mRNA有显著表达，但这些生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；然而在27℃模型组全部雄鱼和BPA组的两条雄鱼的生殖腺中P450arom mRNA没有表达而MIS mRNA有显著的表达。
3 讨论
本研究中发现，雌二醇组雌性占到100％，剂量为1μg/g，只有BPA剂量100μg/g的1/100 。BPA雌性占57.1％，说明它比雌二醇对生殖腺的雌性化作用弱很多，只能在一定程度上抑制27℃较高水温对遗传学雌性比目鱼幼苗的雄性化作用，对生殖腺性分化具有一定的雌激素样作用。这可能因为两者与雌激素受体及其亚型的结合能力有所差别。本研究显示，BPA对27℃幼鱼的雌性化作用使生殖腺分化出了卵巢腔，卵巢腔是雌性卵巢分化特有的形态学标志[７]；通过原位杂交和RT-PCR分析均发现，卵巢腔出现的同时还伴随着P450arom mRNA表达的上调和MIS mRNA表达的下调。P450arom是催化雄激素转化为雌激素的关键酶；MIS是一种雄性体内能够抑制雌性生殖腺发育的激素。同样，原位杂交也显示雌二醇完全诱导雌性化，并在同一个生殖腺中诱导P450arom mRNA表达而抑制MIS mRNA表达，这些结果提示了BPA内分泌干扰作用机制和雌激素一样，是通过调节P450arom 和MIS mRNA的表达来发挥雌性化作用的。然而，BPA对P450arom 和MIS两个基因的转录调节机制仍不太清楚。
最近有研究报道，在鸡的体内，雌性生殖腺中转录因子FOXL2在时间和空间上与P450arom共同存在，并存在于P450arom的上游部位，因为在P450arom启动子内存在FOXL2的结合位点[８]。此外，P450arom酶抑制剂使鸡胚雄性化而导致FOXL2和P450arom mRNA的表达受到抑制[9]。因此，FOXL2很可能是诱导日本比目鱼P450arom转录活性的一个强有力的候选基因。
为了更进一步了解BPA对日本比目鱼这类硬骨鱼模型的性分化影响的分子机制，以后可继续在P450arom 和MIS两个基因的转录调节机制上进行研究，比如探索FOXL2这类转录因子能否直接诱导比目鱼P450arom的转录活性。此类实验研究能为预防此类环境相关性疾病、保护人类健康提供科学依据。
4 参考文献
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[8]Govoroun MS, Pannetier M, Pailhoux E, et al. Isolation of chicken homolog of the FOXL2 gene and comparison of its expression patterns with those of aromatase during ovarian development[Ｊ]. Dev Dyn,2004, 231: 859-870.
[9]Hudson QJ, Smith CA, Sinclair AH. Aromatase inhibition reduces expression of FOXL2 in the embryonic chicken ovary[Ｊ]. Dev Dyn, 2005, 233: 1052-1055.
(收稿日期：（2006-05-23）
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