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【摘要】 目的 观察Smad泛素化调节因子�2(Smurf 2)在慢性移植肾病(CAN)大鼠肾组织的表达及其与CAN大鼠肾脏功能改变、病理学改变之间的关系，探讨Smurf 2在CAN中的作用。 方法 实验组采用近交系大鼠的同种异基因动物间的左肾原位移植，雄性F344大鼠40只为供体，雄性LEW大鼠40只为受体，移植手术后第10天行右肾切除术，对照组采用单肾切除术的雄性大鼠25只。分别于4、8、12、16周及24周处死大鼠，做肾功能、移植肾组织学检测，并借助免疫印迹、逆转录�多聚酶联反应方法检测肾组织中Smurf 2 mRNA、Smurf 2蛋白的表达。结果 移植组大鼠尿蛋白定量、血清肌酐水平于移植后16周时显著增高，24周时更为显著。Smurf 2 mRNA、Smurf 2蛋白在移植后随疾病进展逐渐升高，24周时达高峰。相关分析显示，肾移植大鼠Smurf 2表达水平与24 h尿蛋白定量、血清肌酐水平、肾间质纤维化程度呈正相关(P［1］，其发病机制尚不清楚。转化生长因子β1(transforming growth factor�β1， TGF�β1)在CAN的发生过程中起重要作用［1，6，7］。Smad 泛素化调节因子 2(Smad ubiquitin regulatory factor 2,Smurf 2)在调节TGF�β1/�Smads信号通路中起关键的作用［4］。本研究旨在观察Smurf 2在慢性移植肾病(CAN)大鼠肾组织的表达及其与CAN大鼠肾脏功能改变、病理学改变之间的关系，探讨Smurf 2在CAN中的作用。�
1 资料与方法�
1.1 动物模型 实验大鼠为德国慕尼黑大学馈赠，模型建立见参考文献［5］。�
1.2 主要试剂 抗Smurf 2抗体购置于Santa Cruz 公司。PCR引物由上海生工公司合成。Western�blot检测试剂购置晶美(深圳)生物有限公司。�
1.3 实验方法�
1.3.1 生物与功能检查 乙醚诱导麻醉下处死动物，取移植肾进一步检测，取血清标本测定血肌酐，处死动物前收集24 h尿，送检24 h尿蛋白定量。�
1.3.2 组织学检查及免疫组化、Western�blot方法 方法见参考文献［3］。�
1.3 5RT�PCR扩增 检测Smurf 2 mRNA表达Trizol一步法提取细胞总RNA，引物由上海生工合成。方法见参考文献［5］，基本参数如下。�
1.4 统计学分析 结果用(x±s)表示，组间均数比较用t检验或方差分析，相关性分析用Spearmen等级相关，在SPSS软件上自动运行，P 8周(n=8)12.3±2.7�▲89.2±4.8�#3.50±0.71��#▲�2.21±0.71��#▲�0.085±0.026�▲
12周(n=8)21.6±6.9��#▲�97±7.9��#▲�4.60±1.34��#▲�1.9±0.84��#▲�0.086±0.026�▲
16周(n=8)34.3±11.9��#▲�106±9.1▲5.70±2.00��#▲�1.97±0.68��#▲�0.091±0.030�▲
24周(n=8)90.7±18.1��#▲�110±15��#▲�6.97±2.31��#▲�3.11±0.90��#▲�0.125±0.044��#▲�
对照组
4周(n=5)11.9±4.378±4.71.00±0.020.67±0.58�*0.065±0.024
8周(n=5)10.9±3.286±3.81.20±0.06�*0.00±0.00�*0.061±0.027
12周(n=5)18.8±6.1�*79±2.8�*1.50±0.21�*0.00±0.00�*0.065±0.020
16周(n=5)21.8±7.5�*92±19�*1.67±0.38�*0.00±0.00�*0.059±0.020
24周(n=5)20.1±9.3�*86±35�*1.80±0.40�*0.00±0.00�*0.057±0.016�*
注：同时相移植组相比，�*P［2］。慢性移植肾病是导致移植肾晚期失功的主要原因，尽管目前已知众多免疫因素和非免疫因素与CAN的发生有关［11］，但对CAN的病因及发病机制仍不清楚，临床上CAN主要表现为移植肾功能慢性进行性减退，伴有蛋白尿和高血压。本研究连续观察了大鼠肾移植术后不同时相的功能学变化，结果显示移植肾大鼠在移植后12周出现明显蛋白尿、Scr逐渐增高、肾功能逐渐减退。肾脏病理显示：移植后12周之前，主要表现为肾间质单个核细胞浸润，细胞增殖及血管内膜的断裂；移植后16周时可观察到肾小球硬化、肾间质纤维化及血管硬化等慢性病理改变。此结果提示，移植后12周之前为CAN早期病变，16周之后病变开始转为慢性。�
已知TGF�β1在CAN发病过程中起重要作用［1］。Smads 蛋白是TGF�β1/�Smads信号途径中关键的细胞信号内介质， Smads 信号蛋白的表达可被泛素蛋白酶体途径(UPP)降解。UPP主要由四部分组成：泛素、泛素连接酶、26S蛋白酶体系统和泛素再循环酶。Smurf 2是由748个氨基酸组成的多肽，其羧基端含有一个HECT结构域，因而属于泛素连接酶HECT结构域E3S家族的成员之一［4、5、8、10］。它是由Lin等［9］通过酵母双杂交技术分离鉴定出的具有与Smad 2相互作用的泛素化调节因子。因其特异性识别靶蛋白底物、催化其泛素化，因而在UPP介导的蛋白降解中起到了决定性的作用。�
本研究结果显示肾移植大鼠肾组织中Smurf 2表达部位主要在肾小管间质，肾小球基本未见表达。RT�PCR和免疫印迹结果显示Smurf 2表达在CAN病程中呈时间依赖性逐渐升高的过程，移植24周达最高峰值，与血清肌酐、24 h尿蛋白定量及肾纤维化程度成明显正相关。研究结果同时揭示，随着肾组织内TGF�β1水平表达增加，Smurf 2核酸和蛋白表达量亦增加，这说明，在CAN发病机制中，Smurf 2很可能是TGF�β1发挥生物作用的重要调节因子。而且在移植后12周之前，CAN早期，Smurf 2已开始增加，这提示Smurf 2在CAN早期及疾病进展过程中均发挥了重要作用。因此适时干预Smurf 2的表达，可能为防治CAN提供新的靶点。�
参 考 文 献�
［1］ Jain S, Furness PN, Nicholson ML. The role of transforming growth factor beta in chronic renal allograft nephropathy. Transplantation,
2000,69:1759�1766.�
［2］ Vazquez MA, Chronic rejection of renal transplants: new clinical insights. Am J Med Sci,2000,320:43�58.�
［3］ 贾宁,张桦,林琳,等.泛素在大鼠慢性同种抑制肾病中的表达及作用.中国中西医结合肾病杂志，2006，7(4)：208�211.�
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