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【摘要】目的:建立一种可测定小儿肺热咳喘口服液中黄芩苷的RP-HPLC方法。方法:采用Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm5μm)为色谱柱;流动相为甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58);检测波长为277nm;流速为1.0mL/min;柱温为40℃;峰面积外标法定量;结果:本法黄芩苷在1.044×10-2μg～2.61μg范围内呈良好的线性关系,(r=0.999995),平均回收率为99.0%,RSD0.99%;结论:本方法简便、快速、准确可靠,可作为该制剂的质控方法。
【关键词】小儿肺热咳喘口服液;黄芩苷;高效液相色谱法;含量测定
【中图分类号】R917【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)12-107-2
Determination of baicalin in Xiao’er feire kequan Oral Liquid by RP-HPLC
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Quzhou Institute for Drug Control,Quzhou,China 324002
ABSTRACT:AIM:To establish a RP-HPLC method for determining the content of baicalin in Xiao’er feire kequan Oral Liquid.METHODS:A Shim-pack C_(18)column was used.The mobile phase wasmethanol-0.3%Phosphoric acid solution(42:58).The detection wavelength was 277nm. RESULTS:The linear range of baicalin was1.044×10-2μg～2.61μg(r=0.999995).The average recovery(n=9) was 99.0%.RSD was 0.99%. CONCLUSION:The method is simple,reliable,accurate and can be applied to the quality control of the preparetion.
KEYWORDS:baicalin;Xiao’er feire kequan Oral Liquid;RP-HPLC
小儿肺热咳喘口服液是由麻黄、苦杏仁、黄芩、金银花、石膏等中药组方制成的中药制剂,具有清热解毒,宣肺化痰功效,用于热邪犯于肺卫所致发热、汗出、微恶风寒、咳嗽、痰黄,或兼喘息、口干而渴等症。收载于《中国药典》2005年版一部,原标准对黄芩没有鉴别项控制,也没有含量测定控制[1]。本文采用高效液相色谱法测定小儿肺热咳喘口服液中黄芩苷,结果准确,操作方便,可用于该制剂的质量控制。经方法学研究,证明本法可行。现报道如下。
1仪器与试药
日本岛津LC―2010A高效液相色谱仪,自动进样系统;Lcsolution Version 1.11 SP1色谱数据工作站;日本岛津UV-2100紫外分光光度计;KQ-250B型超声波清洗器(功率:250W,频率:40KHz)。甲醇为色谱纯;磷酸、乙醇均为分析纯;水为重蒸馏水;黄芩苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:黄芩苷110715-200212(供含量测定用)。小儿肺热咳喘口服液(市售,批号:200803061、200803028、200804059、200804079、200805044、200805049)。
2色谱条件
色谱柱:Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm 5μm)为色谱柱;甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58);检测波长为277nm;流速为1.0mL/min;柱温为40℃;峰面积外标法定量。
3方法与结果
3.1供试品溶液的制备
3.1.1样品溶液的制备
取本品适量,混匀,精密量取1mL,置50mL容量瓶中,加入70%乙醇至近刻度,密塞,超声处理10分钟(功率:250W,频率:40KHz),放冷至室温,用70%乙醇加至刻度,摇匀,滤过,取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
3.1.2阴性空白对照溶液的制备
按其质量标准中的处方比例,制备缺味(黄芩)中药的阴性空白样品对照液,照上述样品溶液的制备方法制成阴性空白对照溶液。
3.1.3对照品溶液的制备
精密称取经60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量,加70%乙醇使溶解,定容,制成每1mL含黄芩苷约100μg的对照品溶液。
3.2系统适用性试验
取黄芩苷对照品溶液、阴性空白对照溶液和样品溶液,按上述色谱条件下进10μL,得HPLC图谱,结果见图1。由图1C可知,阴性空白对照溶液在黄芩苷对照品出峰处没有干扰峰出现,故样品中的其他组分对黄芩苷测定无干扰作用。理论塔板数按黄芩苷峰计算不应低于4000。分离度大于1.5,黄芩苷对称因子为0.95～1.05之间。
A.对照品图谱B.样品图谱C.阴性空白对照品图谱
图1 对照品、样品及阴性空白对照液的HPLC图
3.3线性关系的考察
精密称取经60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品13.05mg,置25mL量瓶中,用70%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5mL,置25mL量瓶中,用70%乙醇稀释至刻度,摇匀,作为黄芩苷对照品储备液。分别精密吸取对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10、15、20、25μL,注入高效液相色谱仪,按上述条件测定,记录峰面积,以峰面积(y)为纵坐标、黄芩苷进样浓度(x)为横坐标进行线性回归,得回归方程:黄芩苷Y=3.2529×106X+5.0749×103,r=0.999995,结果表明黄芩苷在1.044×10-2μg～2.61μg之间呈良好的线性关系。
3.4精密度试验
取同一批供试品溶液(批号:200803061),进样10μL,重复进样5次,测得:黄芩苷峰面积的RSD为50.19%。再取黄芩苷对照品溶液,重复进样5次,测得:黄芩苷峰面积的RSD为50.11%。
3.5重复性试验
取同一批号样品5份(批号:200803061),按3.1.1项下样品溶液的制备方法制备供试液,平行测定,得:黄芩苷的含量为3.1725mg・mL-1,RSD为0.26%(n=5)。说明方法重现性良好。
3.6稳定性试验
取同一批号样品溶液(批号:200803061,黄芩苷的含量为3.1725mg・mL-1),在常温下放置12h,每间隔2h测定一次,连续共测定6次,得:黄芩苷峰面积RSD为1.19%。表明样品溶液在12h内稳定性良好。
3.7回收率试验
采用加样回收试验方法,精密量取已知黄芩苷含量(批号:200803061,黄芩苷含量为3.1725mg・mL-1)的样品5mL,置10mL容量瓶中,加入70%乙醇至近刻度,密塞,超声处理10分钟(功率:250W,频率:40KHz),放冷至室温,用70%乙醇加至刻度,摇匀,精密量取9份1mL此样品稀释液,分置50mL容量瓶中,分别加入一定量对照品(加入量分为三个浓度:低、中、高),照3.1.1项下操作,分别按上述色谱条件测定,计算结果见(表1)
3.8样品含量测定
精密量取样品1mL,按3.1.1项下方法制备供试样品溶液。另精密称取黄芩苷对照品适量,同3.1.3项下制备对照品溶液,按上述色谱条件进样10μL,记录黄芩苷峰面积,按外标法计算含量。结果见表2
表2 样品含量测定结果(n=4)
样品批号 黄芩苷含量(mg・mL-1) RSD(%)
200803061
200803028
200804059
200804079
200805044
200805049 3.1725
3.1970
3.1663
2.7192
3.4426
3.2001 0.26
0.11
0.43
0.15
0.66
0.18
4讨论
4.1检测波长的选择取上述黄芩苷对照品溶液,在紫外分光光度计上于波长200nm～500nm处扫描,结果在277nm波长处有最大吸收峰,故以277nm为检测波长。
4.2提取方法的选择笔者曾用70%乙醇、甲醇,分别超声提取10、30、60分钟后进样测定峰面积比较,结果超声处理10分钟以后黄芩苷峰面积基本不变,故选用超声处理10分钟;70%乙醇与甲醇稀释的含量基本一致,考虑到70%乙醇比甲醇更经济环保,故选用70%乙醇超声处理。
4.3柱温的选择柱温虽对组分的分离度影响较小,但对样品组分的保留时间(tR值)影响较大,经反复试验:柱温在40℃时既可加快分析速度,又可保持出峰时间的恒定,从而保证试验结果的重复性和准确性。
4.4流动相的确定笔者比较了甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58)、甲醇-2%醋酸(50:50)、乙腈-水(33:67)、乙腈-0.2%磷酸(30:70)、乙腈-冰醋酸-24%四丁基溴化铵-水(33:1:1:75)等多种流动相,结果以甲醇-0.3%磷酸溶液(42:58)分离效果、出峰时间快、配制简便,综合考虑最好,故选用此为流动相。然后又对甲醇与不同浓度的磷酸溶液配比对峰形的影响进了考察,实验结果表明随着磷酸浓度的增加,峰形进一步变尖锐。但考虑到酸度对色谱柱的影响(要求流动相PH应大于2.0),流动相pH值不宜过低,故选用此比例。
4.5黄芩具清热、燥湿、解毒、止血功效是处方中清热解毒的主要药味,黄芩中主要成分为黄芩苷[2],为此,选择黄芩中的黄芩苷为含量测定指标,建立质量控制标准,结果满意,方法的重现性好,可作为该制剂的质控方法。
4.6存在问题和不足本次实验用样品,为笔者从市场上购买所得,只有六个批号,再者,本次实验用仪器与色谱柱也只有一种,故本实验数据有一定的局限性。
参考文献
[1] 中国药典一部[S].2005:346.
[2] 肖培根.新编中药志(第一卷)[M].北京化学工业出版社,2002:862-875.
