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【摘要】 目的 对神奇灵颗粒剂中的蛋白含量进行测定，建立一种快速测定药品中蛋白含量的方法。方法 对样品溶解、过滤后，采用BCA法，以牛血清白蛋白作为对照品，测定吸光度，并做精密度、样品重现性、加样回收实验。结果 用本法得到样品含量为48.09%，RSD=0.11%；平均回收率为98.81%，RSD=0.51%。结论 应用BCA测蛋白法可作为含有蛋白的药品制剂中蛋白含量的测定方法。�
【关键词】 BCA；蛋白质；神奇灵颗粒剂��
【Abstract】 Objective To determine total protein in Shenqiling granules,and establish the methodology to assay protein level in drugs. Methods After filtering the samples,take bovine serum albumin as control article,use BCA to determine the absorbance,and then do the tests for precision,reproducibility,average recovery. Results The average content of the samples was 48.09% in the precision experiment,RSD=0.11%(n=6). The average recovery was 98.81%,RSD=0.51%. Conclusion The method in this paper can be used for determining protein in drugs.�
【Key words】 BCA;Protein;Shenqiling granules
二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA ）法是近年来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowry法相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并且与蛋白浓度成正比，据此可测算蛋白质浓度。与Lowry法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高、操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是受杂质的影响较小[1]。�
神奇灵颗粒是由几种中药的水提取物，辅以乳清蛋白、蜂蜜等按一定比例加工成型的一种保健食品，具有改善机体免疫功能、调节人体的适应状态功能，适用于机体免疫功能低下，运动状态下降以及体力虚弱等的人群，其中蛋白质是主要的功效成分。《中国药典》以及食品标准中传统的方法是用凯氏定氮法，虽然测定准确，但操作繁琐费时，需经过冗长的消化、蒸馏等处理过程，而且容易产生有毒的气体，不适宜快速、简便地测定一般食品药品中的蛋白含量。本文采用BCA法测定神奇灵颗粒剂中蛋白的含量，从而为药品检测建立一种快速、准确测定蛋白含量的方法。�
1 材料 �
1.1 仪器 ELX-800型酶标仪(美国宝特公司)；梅特勒AG285电子天平。�
1.2 试剂 BCA蛋白测量试剂盒（北京天来生物医药科技有限公司）；神奇灵颗粒剂（广东省体育科学研究所提供，批号20061107）；其余试剂均为国产分析纯，文中所用水均为二蒸水。 �
2 方法与结果�
2.1 标准曲线的绘制 根据BCA蛋白测量试剂盒说明书操作配制“工作液”。按50体积BCA试剂A溶液加1体积BCA试剂B溶液配制，充分混匀备用。�
取试剂盒中蛋白标准品-牛血清蛋白10 μl，用0.9％生理盐水90 μl稀释，使终浓度为0.5 mg/ml，此即为标准品稀释液。精密吸取标准品稀释液按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加入到96孔平板的标准品孔中，加0.9％NaCl补足到20 μl。向标准品孔中加入200 μl BCA工作液，轻微振荡，混匀于37℃恒温水浴中温育30 min。取出平板于酶标仪上测定吸光度，测定波长为570 nm和595 nm。见图1和图2。 �
以吸光度为纵坐标（y）、标准品质量为横坐标（x）,进行回归运算，求得曲线方程分别为y=1.71×10-2x+8.00×10-3，r=0.9838；y=4.82×10-2x+5.60×10-3，r=0.9996。可见当波长为595 nm时，吸光度与标准品质量相关系数好，r为0.9996。故选用波长为595 nm的方程。
2.2 样品溶液的制备与测定 取一定量的本品，在研钵中研磨粉碎，精密称取0.399 8 g，加水后超声20 min使之溶解，过滤，定容至25 ml，取1 ml，按照标准曲线项下的方法，把样品加入到96孔平板中的样品孔中，测定吸光度，按照标准曲线计算蛋白质的含量。�
2.3 重现性实验 分别精密称取6份样品，加入到96孔平板的样品孔中，依照样品的测定方法，得到吸光度，计算蛋白质的含量，计算平均值及RSD。见表1。�
样品平均含量为48.09%，RSD为0.11%，n=6。说明该方法测定该样品误差范围较小，方法准确性高，方法切实可行。�
2.4 加样回收实验 精密称取6份已知含量的样品，加入一定量的标准品试液，同供试品的方法定容于25 ml水制备，测定吸光度，计算平均回收率，及RSD。见表2。�
平均回收率为98.81%，RSD=0.51%，说明该法以及在样品处理过程中损失较少，操作可行性很大。�
3 讨论�
蛋白含量测定方法有很多种，常见的有微量凯氏定氮法，利用被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨气，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。蛋白含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘以系数6.25，即可得到该样品的蛋白质含量；Lowry法，因为蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-），因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂），蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比；紫外分光光度法，是由于蛋白质分子中芳香氨基酸的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有紫外吸收的性质，吸收高峰在280 nm处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度与其含量成正比关系，因此可以定量测定；考马斯亮蓝染色法在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595 nm波长处的光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。�
参 考 文 献�
［1］ 莫姣娇,孙强.昆虫蛋白质含量的测定方法.安徽农学通报, 2007,13(11):40-42.�
［2］ 王全喜,王一飞,杨珂，等.神奇灵颗粒剂中总蛋白含量测定的方法.时珍国医国药,2007,18(4)790-791.�
