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【摘 要】 目的 研究次声作用后大鼠CA1区谷氨酸转运蛋白亚型Ⅱ(EAAT2)mRNA表达水平变化及其意义。方法 SD大鼠80只随机分为对照组及次声作用1、7和14次组,将大鼠暴露于8 Hz、130 dB次声,2 h/次,1次/d,按上述规定次数在次声压力仓内作用后,采用实时定量PCR法检测CA1区的EAAT2 mRNA表达变化情况。结果与对照组EAAT2 mRNA比较,8 Hz、130 dB的次声作用1次后,EAAT2 mRNA表达水平即发生了上调,7次组显著上调,14次组则略有恢复,但表达水平仍高于对照组。结论次声脑损伤后,谷氨酸在细胞外堆积,产生神经毒性,可能与谷氨酸转运蛋白下调,重吸收障碍有关。上调EAAT或促进其核酸表达可能对次声脑损伤后脑组织有保护作用。
【关键词】 次声;脑损伤;EAAT2 mRNA
【Abstract】 ObjectiveTo study the alterations and significance of expressions of EAAT2 mRNA in CA1 of rats after infrasonic damage.MethodsEighty SD rats were randomized into four groups: control group and one-time, 7-time, 14-time infrasonic damage group. Rats were exposed to infrasound with 8Hz,130dB, 2 hours once a day. EAAT2 mRNA was detected by real-time PCR methods.Results EAAT2"s mRNA have a tendency of up-regulation after infrasonic damage. It was showed that in 1-time group EAAT2"s mRNA was up regulation compared with that of control group.In 7-time and 14-time group, the up-regulation of EAAT2 was more severe than that of control group.Conclusion Increase of glutamate produce the neurotoxicity and may be concerned with the down regulation of EAAT2 after infrasonic brain damage. The down-regulation of EAAT2 may lead to the disorder of glutamate"s reabsorption and result in secondary brain damages.Therefore the up-regulation of EAAT2"s mRNA may provide protection effect for the brain after infrasonic damage.
【Key words】Infrasound;Brain injury;EAAT2"s mRNA
次声是一种频率低于20 Hz的弹性波。其作用的基本原理是直接引起机体组织及脏器的共振,产生一系列的生物学效应。在次声引起的各脏器结构与功能损伤中,中枢神经系统的损伤最为明显,较早地出现功能障碍[1]。谷氨酸是中枢神经系统广泛存在、含量最高的氨基酸,对大脑皮层具有广泛而强烈的兴奋作用,是脑内最具代表性的兴奋性神经递质之一,它与神经元的发育和死亡,突触的传递和可塑性以及一些神经疾病的发生密切相关[2-3]。颅脑损伤后,细胞外谷氨酸蓄积,可引起神经细胞的多种急、慢性病理损害。目前认为,细胞外没有使谷氨酸代谢失活的酶,而使谷氨酸在神经系统灭活的唯一途径是通过神经细胞的再摄取和吸收,其中起主要作用的是谷氨酸转运蛋白[4]。因此谷氨酸转运蛋白的表达变化在神经元损伤机制中起着重要作用。本实验拟研究次声作用后大鼠海马CA1区谷氨酸转运蛋白亚型Ⅱ(EAAT2)mRNA表达变化规律,探讨其在次声脑损害中的作用,为次声脑损伤机制及寻求相应的保护手段提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料成年雄性SD大鼠80只,体质量(180±15)g,由第四军医大学实验动物中心提供[许可证号:SCXK(军)2002-005]。次声模型采用第四军医大学与航天工业部41所共同研制的次声压力仓制备。实验用EAAT2引物及Oligo(DT)引物由上海生工合成。Taq酶购自TaKaRa公司,TRzol试剂、凝胶回收试剂盒购自Sigma公司,TOPO TA Cloning试剂盒、SuperScriptⅡ反转录酶购自Invitrogen公司,质粒回收试剂盒购自Qiagen公司,DNA纯化回收试剂盒购自天根生物制品公司,地高辛标记NTP及抗体、T7、SP6酶购自罗氏公司。实时定量PCR仪为美国伯乐公司生产。
1.2方法
1.2.1实验模型的制备将动物随机分为正常对照组、次声作用1、7及14次共4组,每组20只,其中,原位杂交、实时定量PCR各10只。实验用8 Hz、130 dB的次声,除对照组每日按规定次数在次声压力仓内滞留2 h而无次声作用外,其余各组按上述规定次数每日在次声压力仓内全身作用2 h。各组动物在次声作用后1 h内进行脑组织标本取材。
1.2.2实时定量PCR法取各实验组动物海马组织,匀浆后提取总RNA,反转录合成cDNA并以其为模板,用EAAT2特异引物(5"-GGGTCATCCTGGATGGAGGTC-3",5"-CGTGTCGTCATAAACGGACTG -3")、Taq酶、SYBR GreenⅠ进行定量PCR反应。用10倍稀释的质粒为模板进行PCR,制作标准曲线,根据样品Ct值和标准曲线对样品起始模板cDNA进行相对定量分析,以反映EAAT2 mRNA表达变化趋势(图1)。采用β-actin(5"-AAC CCT AAG GCC AAC CGT GAA AAG-3",5"-TCA TGA GGT AGT CTG TCA GGT-3")作内参。
1.2.3统计分析各组数据以x±s表示,采用多个样本均数比较的方差分析及多重比较的LSD-t检验进行统计学分析。P
3讨论
机体脏器如中枢神经系统的固有频率为8～12 Hz,在次声作用下可发生共振效应,造成一系列形态和机能改变。以往研究表明,次声作用后可造成细胞超微结构的改变,如神经元胞核形态不规则,核膜变形,染色质边集,核固缩,胞浆中有大量微丝形成,细胞器数目明显减少,线粒体肿胀,嵴断裂、减少、消失、空泡样变[5-6]。谷氨酸作为哺乳类动物中枢神经系统中最重要的兴奋性递质之一,正常情况下,大部分存在于细胞内,仅少量存在于细胞间隙,胞膜两侧浓度差可达数千倍[7]。这种较高的浓度差有赖于谷氨酸转运蛋白来维持。病理情况下,谷氨酸转运蛋白数量或活性下降,可造成细胞外谷氨酸蓄积过多,产生神经毒性作用。EAAT2为重要的谷氨酸转运体亚型,在中枢神经系统中分布广泛,其在谷氨酸摄取过程中起着重要作用[8-9]。
对谷氨酸转运体EAAT2的研究,以往多为蛋白水平的检测,用实时定量PCR方法对其核酸水平进行检测的报道很少。本结果显示,与对照组比较,在次声作用1次后,EAAT2 mRNA即发生上调,连续作用7次后,其表达明显上调,14次后其略有恢复。其原因可能是脑组织在次声损伤后,出现细胞结构损害、能量代谢障碍、氧自由基增多等改变,引起谷氨酸转运蛋白活性下降,细胞外谷氨酸蓄积过多。在损伤刺激下,神经细胞表达EAAT2 mRNA增多,增加EAAT2的合成,以加强对谷氨酸的清除能力,防止进一步的神经损伤。本结果显示,谷氨酸转运蛋白EAAT2在细胞损伤中发挥着重要作用,若在脑组织发生损伤后及时上调EAAT2和(或)加强其mRNA表达,可能会对脑组织损伤有保护作用。
参考文献
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(收稿日期:2009-07-11)
