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[摘要] 目的 研究胎盘生长因子（PLGF）在乙肝肝硬化组织中的表达及其意义。方法 对乙肝肝硬化终末期行肝移植术的切除肝10例和肝移植供体肝组织8例用RT-PCR和免疫组化方法检测PLGF mRNA及蛋白的表达。结果 PLGF mRNA和蛋白在肝硬化组织中有表达，均明显高于正常肝组织中的表达水平，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。结论 PLGF在乙肝肝硬化组织中表达增加，不仅参与其中的炎症过程，并且可能在肝硬化向肝癌发展的过程中起重要作用。
[关键词] 乙型病毒性肝炎；肝硬化；胎盘生长因子
[中图分类号] R575.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）24-76-02
Expression and Significance of Placenta Growth Factor in Tissue of Hepatic Cirrhosis after Viral Hepatitis Type B
LIN Shengdi1 CHEN Weilai2 PAN Chenwei3 LIN Wei3 TAO Chonglin4
1.Department of Intensive Care Unit， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China； 2.Department of Neurology， the Third People"s Hospital of Wenzhou， Wenzhou 325000， China； 3.Department of Infectious Disease， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China； 4.Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To investigate expression of placenta growth factor（PLGF）in the tissue of hepatic cirrhosis after viral hepatitis type B， and to explore the clinical significance of PLGF. Methods Expression of PLGF mRNA and protein in surgical specimens which including 10 samples of hepatic cirrhosis liver tissue and 8 samples of normal hepatic tissues were detected by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. Results Levels of mRNA and protein of PLGF expressed in hepatic cirrhosis liver tissue were higher than those in normal hepatic tissue significantly （all P＜0.01）. Conclusion PLGF which got higher expression in the tissue of hepatic cirrhosis not only take part in the processes of hepatic cirrhosis， but also possibly play important roles in the processes of tumorigenesis in hepatic cirrhosis liver tissue.
[Key words] Viral hepatitis type B； Hepatic cirrhosis； Placenta growth factor
肝硬化是一种常见的慢性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用，引起肝脏弥漫性损害。在我国，病毒性肝炎（尤其是乙型）是引起肝硬化的主要原因[1]。胎盘生长因子（placenta growth factor，PLGF）属血管内皮生长因子家族，它最早于1991年由Maglione等从人的胎盘cDNA文库中分离纯化而得，目前关于肝硬化组织中PLGF表达的研究国内外鲜见报道。本实验通过研究PLGF在肝硬化组织中的表达，探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本
2005年1月～2008年12月收集于浙江省温州医学院附属第一医院手术切除的肝组织及肝移植手术供体肝。肝硬化肝组织（tissue of hepatic cirrhosis liver）10例，均为肝硬化终末期行肝移植术的切除肝，病理诊断为肝硬化肝组织。正常肝组织（normal hepatic tissue）8例（肝移植手术供体肝，病理证实为正常肝组织），作为对照组。
1.2 实验试剂
即用型SABC免疫组化试剂盒，PLGF多克隆抗体（ABCAM公司）；DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Trizol（Sigma公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司）；总RNA提取试剂盒（美国Life Technologies公司）；RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）。
1.3 PCR引物
引物序列通过Primer Premier 5.0软件设计，经过PubMed Blast确认，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列：β-actin：正链5’-TCG ACA ACG GCT CCG GCA T-3’，负链5’-AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3’，产物241bp；PLGF：正链5’-CTG CTG TCT GCG GAG GAA-3’，负链5’-ACA AGG GAA CGA AGG ACG-3’，产物380bp。
1.4 免疫组化方法检测标本PLGF蛋白表达
以4%多聚甲醛固定标本组织块24h，常规石蜡包埋，连续石蜡切片，厚约4μm。石蜡切片脱蜡水化。3% H2O2室温孵育20min，双蒸水冲洗，PBS浸泡后，抗原修复采用枸橼酸缓冲液中微波修复15min，PBS冲洗，山羊血清封闭，室温孵育后倾去血清，滴加一抗工作液，37℃孵育2h，PBS冲洗后滴加二抗工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗，滴加辣根酶标记SP工作液，37℃孵育30min，经PBS冲洗，DAB显色剂显色以及苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。PLGF免疫组化结果使用美国Image-Pro Plus 5.0专业图像分析软件测定平均光密度值，重复3次，取平均吸光度值作为蛋白的相对含量[2]。
1.5 RT-PCR方法检测PLGF mRNA水平表达
Trizol法抽提总RNA，常规逆转录成cDNA后进行PCR扩增。在PCR仪内，94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃ 5min。4℃保存。2h内PCR产物电泳，电压120V 30min。电泳结束后取出凝胶，Image Master VDS成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件（Total lab V101）行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin的PCR产物条带灰度比值作为反映目的基因mRNA水平的相对指标，RT-PCR反应体系中未加入逆转录酶的作为空白对照[2]。
1.6 统计学处理
所有试验数据进行正态性检验，组间比较使用t检验，均在SPSS11.5软件上完成。
2 结果
2.1 PLGF免疫组化结果
肝硬化组的PLGF蛋白表达高于正常肝组（封三图1、图2），差异有显著统计学意义（t=14.062，P＜0.01）。见表1。
2.2 PLGF RT-PCR结果
肝硬化组的PLGF mRNA产物条带平均光密度比值明显高于正常肝组（封三图3），差异有显著统计学意义（t=9.952，P＜0.01）。见表1。
3 讨论
临床上，对于慢乙肝患者的转归有肝炎-肝硬化-肝癌三部曲一说。其中，对于乙肝肝硬化的研究尤为值得重视，但既往研究中少有设正常肝组织对照。本研究中采用肝移植供体肝（病理诊断均为确切的正常肝，临床上也排除了肝炎和慢性肝病）作为乙肝后肝硬化（病理诊断为肝硬化，未发现肝癌）的对照组，完善了实验设计。
肝硬化的主要发病机制是肝脏组织在各种因素损伤下的持续性长期的炎症导致的进行性纤维化，最终使肝小叶结构和血液循环改建而形成肝硬化[3]。多个研究表明胎盘生长因子与许多炎症有关，在炎症过程中由炎症细胞产生并作为其趋化因子，参与如类风湿性关节炎、过敏反应多种炎性病理过程[4，5]。乙肝肝硬化的形成过程也可以说是一个炎症性的病理过程，PLGF的产生可能与肝内受刺激的血管内皮细胞或者炎症细胞有关。本实验中，肝硬化组织中PLGF mRNA及蛋白有较高水平的表达，而正常肝几乎无表达，证实PLGF高表达与肝硬化组织中不断发生的炎症反应密切相关，这种现象也说明不仅肝硬化形成过程是炎症过程，而且肝硬化形成后的组织中同样具有类似上述疾病炎症病理过程的特点。因此，肝硬化形成后，病情并未就此稳定，而是仍在进展。而且PLGF的表达水平与炎症程度具有一定的联系，其相关性有待进一步探讨。
此外，既往的研究中报道缺氧可以诱导血管内皮生长因子家族成员的高表达，缺氧上调VEGF基因表达主要与缺氧诱导的特异性DNA结合蛋白缺氧诱导因子密切相关[6，7]。PLGF作为该家族中的重要成员，应该具有此种特点，缺氧可能是引起肝硬化组织PLGF高表达的另一原因。乙肝肝硬化组织由于纤维组织的影响，肝组织细胞因血供不足而存在缺氧的状态；PLGF在肝组织缺氧的环境中表达增强，与文献报道符合。另外，PLGF的产生增多可以说是肝脏机体缺氧负反馈调节过程的一种反应，因为PLGF产生于缺氧环境，又可通过其生物学功能发挥着调节血管功能的作用，从而改善肝脏组织的血供。
因此，PLGF在乙肝后肝硬化的形成过程中表达增加，在肝脏炎症性病理过程中扮演一定的角色，其机制有待进一步研究。此外，PLGF是参与多种肿瘤血管生成的重要的促血管生成因子，多种肿瘤的形成（包括肝癌）与PLGF有关[2，8，9]；并且，多个研究小组报道了PLGF在各种实体瘤中的表达上调，过度的PLGF表达导致肿瘤生长速度加快[10]；而约10%～15%的肝硬化患者可发生原发性肝癌。因此肝硬化组织中PLGF的高表达可能参与了肝硬化向肝癌发展的过程，甚至可能发挥了十分重要的作用，有待更多的实验去证实。
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（收稿日期：2011-05-26）
