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[摘要] 目的探讨如意金黄散的微生物限度检查方法。方法按《中国药典》2010年版微生物限度检查法进行验证和试验。结果 经方法学验证实验得出，如意金黄散有抑菌作用，其微生物限度检查计数方法采用培养基稀释法（0.5mL/皿，1∶20的供试液），控制菌检查按培养基稀释法（铜绿假单孢菌采用100mL BL增菌液；金黄色葡萄球菌采用200mL营养肉汤，1∶20的供试液）进行。结论 经验证该微生物限度检查方法适用于如意金黄散的微生物限度检查。
[关键词] 微生物限度检查；验证；如意金黄散
[中图分类号] R286.0[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）19-97-02
Study on the Method of Microbial Limit Test for Ruyi Jinhuang San
GAO HongLI KaiZHU Huiqin
Ningxia Institute for Drug Control, Yinchuan 750001, China
[Abstract] Objective To establish the method of microbial limit test for Ruyi Jinhuang San. Methods The validation test was carried out according to Chinese Pharmacopoeia (Chp 2010). Results The results of validation test showed Ruyi Jinhuang San had antibacterial activity. The culture media dilution method was used as the counting methods for the bacteria, moulds and yeasts (0.5mL/dish, 1∶20 sample solution) and the controlled bacteria detection test. Conclusion This method is feasible for the microbial limit test of Ruyi Jinhuang San.
[Key words] Microbial limit test; Validation; Ruyi Jinhuang San
为确保微生物限度检查方法的可靠性和准确性，《中国药典》2010年版规定对微生物限度检查方法需进行验证。目前，绝大多数药品的微生物限度检查方法药典中都未有具体的检查方法，都需要进行验证试验后建立。如意金黄散具有清热解毒、消肿止痛的功效，是国家评价性抽验样品品种之一。为了比较全面地反映此药品的整体质量，确保人民用药安全，另一方面也是为了更好地完成国家评价性抽验样品工作，为国家制定政策提供参考依据，本文对如意金黄散的微生物限度具体检查方法进行了验证和总结，供同行参考。
1材料与方法
1.1仪器
高压灭菌器，恒温恒湿培养箱（32.5℃、25.5℃）。
1.2药品
如意金黄散七个厂家56个批次（样品来自全国各地市售及生产厂家）。
1.3培养基
营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基。胆盐乳糖增菌液（BL增菌液），营养肉汤或亚碲酸钾肉汤，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.4菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。
1.5方法
菌液、供试液制备按中国药典2010年版二部附录ⅩⅢ C[1]进行。
按中国药典2010年版二部附录ⅩⅢ C进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验、控制菌检查方法的验证试验和样品检验。
2结果
2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验结果
2.1.1常规法取如意金黄散七个厂家26个批次的1�10供试液各1mL按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验。结果为24批样品大肠埃希菌、白色念珠菌试验组和稀释剂对照组回收率都＞70%；个别几个试验组＜70%而＞50%。而26批样品金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验组回收率都＜10%，黑曲霉菌的试验组回收率都＜60%而＞40%；其稀释剂对照组回收率都＞70%；表明供试品在此条件下对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌有不同程度的抗菌活性。综合验证试验结果得出如意金黄散按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数，方法学验证试验不成立，需要建立新的检验方法。常规法的验证试验结果同时也表明细菌计数的敏感菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；而霉菌及酵母菌计数的敏感菌为黑曲霉菌。
2.1.2 培养基稀释法、薄膜过滤法、上清液法（1）培养基稀释法：取1�10或1�20供试液1mL，分别注入2个或5个平皿中，每个平皿0.5mL或0.2mL。同时每个平皿加入含50～100cfu的1mL试验菌，立即倾注相应的培养基，培养后计数。（2）上清液法：取1�10供试液摇匀后静置10min，取其上清液按常规法或培养基稀释法试验。（3）薄膜过滤法：取1:10供试液摇匀后静置10min或500r/min低速离心5min，取其上清液1mL于100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，按薄膜过滤法操作。
26批样品计数方法按其敏感菌进行培养基稀释法、上清液法、薄膜过滤法验证试验，结果见表1。
表1结果得到枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌在培养基稀释法0.2mL/皿（1�10供试液）或培养基稀释法0.5mL/皿[1�20供试液或上清液（1�10）]或薄膜过滤法条件下试验组和稀释剂对照组回收率均＞70%，表明供试液在此条件下对其基本无抑菌作用。细菌、霉菌及酵母菌计数按培养基稀释法0.2mL/皿（1�10供试液）或培养基稀释法0.5mL/皿[1�20供试液或上清液（1�10）]或薄膜过滤法进行都可行。
2.2控制菌检查方法的验证试验结果
对七个厂家共26个不同批次的样品按常规法、培养基稀释法即取1�10、1�20供试液各10mL分别加入100mL、200mL和400mL BL增菌液和营养肉汤或亚碲酸钾肉汤进行两个控制菌铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌验证试验，结果见表2。
结果为七个厂家共26个不同批次样品试验组常规法、培养基稀释法都检出控制菌铜绿假单孢菌；1�10的供试液其培养基稀释法400mL都检出金黄色葡萄球菌；1�20的供试液其培养基稀释法200mL、400mL都检出金黄色葡萄球菌；表明该样品溶液在此条件下对铜绿假单孢菌无抑制作用，铜绿假单孢菌的检查采用常规法就可以；而该样品溶液对金黄色葡萄球菌有一定程度的抑制作用，金黄色葡萄球菌的检查要采用培养基稀释法。
通过方法学验证实验得出，如意金黄散采用培养基稀释法0.5mL/皿（1�20）进行细菌、霉菌及酵母菌计数检查，控制菌铜绿假单孢菌检查可按常规法进行，金黄色葡萄球菌的检查采用培养基稀释法200mL（1�20）。按照上述验证过的检查方法对56批如意金黄散进行微生物限度检查，结果都符合规定。
3讨论
控制菌金黄色葡萄球菌的检查虽然也可以采用亚碲酸钾肉汤增菌，但由于亚碲酸钾微溶于灭菌水，溶解时要适当加温；亚碲酸钾对热不稳定，加温温度不能太高，最好溶解后马上使用，否则极易析出结晶；此外亚碲酸钾的加入量要适合，不能超过0.002%，否则亚碲酸钾也抑制金黄色葡萄球菌的良好生长。因此样品杂菌不多时，建议还是采用营养肉汤增菌。
计数方法采用培养基稀释法0.2mL/皿（1�10供试液）或培养基稀释法0.5mL/皿[1�20供试液或上清液（1�10）]或薄膜过滤法都可行，但考虑到样品数量多，计数方法采用培养基稀释法（0.2mL/皿，1∶10的供试液），双碟用量多，费时费力，成本也高；上清液法、薄膜过滤法操作繁琐些。本着简便、快速、节约成本及同时考虑到控制菌的检查，最终选用培养基稀释法（0.5mL/皿，1∶20的供试液）作为计数方法。
如意金黄散生产厂家不同，即使是同一个生产厂家，其有抑菌作用的原药材来源不同，其抑菌作用也不一样，其微生物限度检查方法也就不同；为了统一制定出适合各厂家同一品种的微生物限度检查方法，我们对同一厂家3～4个不同批次进行试验，选取各厂家各批次都可行的方法作为此品种的微生物限度检查方法。
[参考文献]
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[2] 朱会琴，李奋勇，李凯，等. 几种微生物限度检查方法的比较[J]. 西北药学杂志，2007，22（6）：323-324.
[3] 刘鹏，马仕洪，戴�，等. 加替沙星微生物限度检查方法的建立[J]. 药物分析杂志，2007，27（6）：881-884.
[4] 李继扬，陆金根，曹永清，等. 复黄片微生物限度检查法的建立[J]. 复旦学报（医学版），2008，35（6）：922-924，934.
（收稿日期：2011-04-21）
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