【www.zhangdahai.com--保证书】
【摘要】 目的 建立生产系统中氟尿嘧啶清洁后残留量的测定方法,保证氟尿嘧啶残留量达到允许的范围,降低对其他产品造成污染的风险。方法 采用高效液相色谱法Symmetry shield TM RP C18柱(4.6×150 mm ,5 μm),以甲醇水(10:90)为流动相,检测波长为265nm,流速为1.0 ml/min。结果 氟尿嘧啶残留在0.10 μg/ml~0.7 μg/ml之间,峰面积与量呈线性关系(r=0.9999 )。平均回收率为99.1%。结论 本法具有专属、可靠、灵敏度高、干扰小等特点,可作为氟尿嘧啶清洁后残留量的测定方法。
【关键词】 高效液相色谱法;氟尿嘧啶;残留含量;测定
Determining the residues content of Fluorouracil on cleanning validation
YAN Zhanshe,LV Meili,QINYing.
Xi’an Haixin Pharmaceutical Co.Ltd ,Xi’an710075,China
【Abstract】 Objective To set up a method for determination of the content of Fluorouracil on cleanning validation to Assuring the residues content of Fluorouracil being in allowing range.and to reduce the risk of polluting other product.Methods HPLC method was used.The sample was separated by Symmetry shield TM RP C18 column(4.6×150 mm ,5um).The mobile phase was methanolwater(10:90).The detection wavelength was 265 nm. Flow rate was 1.0 ml/min. Results When the residues content of Fluorouracil were between 0.10 μg/ml and 0.7 μg/ml,the peak area and content was linear (r=0.9999).The Average recover rate was 99.1%.Conclusion The method is technical, credibility, sensitive. It can be a method for determining the residues content of Fluorouracil on cleanning validation.
【Key words】 HPLC;Fluorouracil; Residue content; Determine
氟尿嘧啶氯化钠注射液为肿瘤治疗药物[1],其活性成分氟尿嘧啶对人体有较大影响,必须制定严格的清洁程序,清洁后残留量必须进行检测。为了有效控制产品质量,保证用药的安全和有效,其残留量检测方法必须准确,可靠,并有较高的灵敏度。本研究采用高效液相色谱法对氟尿嘧啶残留量进行测定,结果表明能有效测定出清洁后氟尿嘧啶的残留量。
1 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪包括600泵、2487紫外检测器、millennium32色谱工作站、C18色谱柱( 4.6×150 mm,5 μm),UV1900紫外可见分光光度计。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:十八烷基键合硅胶柱,流动相:甲醇水(10:90),检测波长:265nm,柱温:室温,流速:1.0 ml/min。
2.2 最小检出量 精密称定氟尿嘧啶对照品1 mg,置100 ml量瓶中,加水适量,超声10 min溶解,用水稀释至刻度,摇匀。精密量取上述溶液1 ml置100 ml量瓶用水稀释至刻度,摇匀。进样20 μl,记录色谱图(见图1),最小检出量约为1ng,可满足检测需要。
2.3 线性关系考察 根据检测残留量的要求,需检测到0.1 μg/ml氟尿嘧啶。精密称定氟尿嘧啶对照品10 mg,置100 ml量瓶中,加水适量,超声10 min溶解,用水稀释至刻度,摇匀。精密量取上述溶液10 ml置100 ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;分别吸取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml,分别置10 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,分别吸取20 μl,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积积分值为纵坐标,氟尿嘧啶量横坐标,绘制标准曲线(见图2)。氟尿嘧啶在0.1 μg/ml~0.7 μg/ml之间,峰面积与量呈线性关系。计算回归方程Y=61274.29X+239.71 r=0.9999。表明氟尿嘧啶在0.1 μg/ml~0.7 μg/ml范围内有良好的线性关系。
2.4 精密度试验
取上述4号对照品溶液0.40 μg/ml,吸取20 μl,按色谱条件重复进样5次,测定峰面积。精密度为0.33%。
2.5 稳定性试验 取上述2.3项4号对照品溶液,分别于0、1、4、8、12、24 h,精密吸取20 μl,按上述色谱条件测定峰面积积分值。精密度为0.59%。
2.6 干扰试验 取空白对照溶液,按上述色谱条件,进样20 μl,与供试品溶液、对照品溶液色谱图对照,结果表明:空白对照无干扰。(结果见图3)
2.7 回收率试验 采用加样精密量取已知含量样品5份各50 ml,水浴浓缩后,置50 ml量瓶中 ,用水洗涤挥发皿,并入量瓶,每份加入氟尿嘧啶对照品溶液(10 μg/ml)1 ml,用水定容,得5份供试液,按上述色谱条件,每份进样20 μl,测定峰面积,计算加样回收率;加样回收率为99.1%,结果表明:本品具有良好的回收率。
2.8 取样效率 为保证取样效率[2],应保证取样效率≥60%。用棉签取样,适于在关键或最难清洗部位取样,以保证活性物质的残留符合标准要求。棉签取样面积约为100 cm�2。
精密称取氟尿嘧啶对照品适量,加水制成0.016%溶液,取此溶液定量装入喷雾器,将10 ml溶液均匀喷洒在不锈钢板上(在500×500 mm的不锈钢板上划出6块100×100 mm的方块,均匀喷洒在6块方块上),自然晾干后,用水润湿的棉签均匀擦拭方块,每擦一块换一根棉签,每一棉签,溶解于10 ml水中,并放置10 min。滤过,取续滤液为供试品溶液。 同法共制备6份均匀喷洒的供试液(理论量10 μg/ml);精密量取供试品溶液和对照品溶液各20 μl注入液相色谱仪,记录色谱图,计算含量。取样效率为91.5%。92.3%,91.8%,90.5%,97.3%,96.6%,平均值为93.3%,结果表明用棉签取样,可保证取样效率。
2.9 样品测定 按标准清洁程序对生产系统清洁完毕后,采用棉签擦拭法对最难清洁部分取样,取样面积100 cm�2,用10 ml水溶解棉签擦拭样品,经过0.22 μm滤膜过滤后,按色谱条件进样20 μl,记录色谱图。见图4,计算含量,结果见表1。
3 讨论
3.1 检测方法确定 药典规定氟尿嘧啶测定方法为紫外分光光度法[3],但用此法无法检出0.1 μg/ml的样品,灵敏度无法达到检测氟尿嘧啶残留的目的,所以采用高效液相色谱法。
3.2 流动相的确定 文献多报道[4]测定氟尿嘧啶的流动相为乙腈-水(30:70),流速为1.0 ml/min,经多次实验,确定流动相为甲醇-水(10:90),流速为1.0 ml/min,不仅样品的分离效果最好,而且灵敏度较高,理论塔板数按氟尿嘧啶峰计算为13574。
3.3 检测波长的确定 取氟尿嘧啶对照品适量,以水为溶剂稀释制成10 μg/ml的溶液。在紫外可见分光光度计上于200~450 nm扫描。结果表明氟尿嘧啶在265 m波长处有最大吸收;空白溶液在此波长处无吸收,因此选择265nm作为氟尿嘧啶的检测波长。
3.4 溶剂的确定 通过多次实验,证实用水溶解样品(对照品)能取得较好的溶解效果,且取样对生产系统不会造成再次污染。
参 考 文 献
[1] 国家药典委员会.临床用药须知,2005:659660.
[2] 朱世斌.药品生产质量管理工程.化学工业出版社,2001:379389.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典,2005:395396.
[4] 付秀娟,葛鹏,狄海涛.反相高效液相色谱法测定祛白灵凝胶中氟尿嘧啶含量.白求恩医科大学学报,1999,25(1):101103.
