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[摘要]目的：研究重组人生长激素(rhGH)在体外对人食管癌细胞生长的影响。方法：实验分为对照组、rhGH组、奈达铂(nedaplatin，NDP)组和rhGH+NDP组共4组，利用体外细胞培养、MTT比色法、流式细胞术及免疫细胞化学等方法，测定不同浓度的rhGH对人食管癌细胞株EC109细胞抑制率、细胞周期、增殖指数(Pi)及核增殖抗原Ki-67表达的影响。结果：rhGH在体外不能明显促进EC109细胞分裂增殖，对照组与rhGH组、rhGH+NDP组与NDP组比较细胞抑制率、PI、Ki-67表达强度差异均无统计学意义(均P>0.05)；rhGH各亚组间比较差异亦无统计学意义(均P>0.05)；NDP组、rhGH+NDP组与rhGH组、对照组比较细胞抑制率增加，阻滞于C0－G0期的细胞数增加，S期细胞明显减少，PI明显降低，Ki-67表达强度明显下降(均P-1)组、rhGH组和rhGH+NDP组，后两组根据rhGH浓度不同分为rh-GHI、rhGH2、rhGH3、rhGH4 4个亚组，rhGH浓度依次为50、100、200及400 ng-ml-1。
1．3 细胞培养
EC109细胞在含10％小牛血清的RPMI 1640完全培养液(含青霉素100u・ml-1，链霉素100u・ml-1)中，于37℃含体积分数为5％CO2、95％空气的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶1～2ml(50ml培养瓶)消化，用4g・L-1苔盼蓝染色后计算细胞存活率，细胞存活率达99％时进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×105个・ml-1备用。
1．4 MTT比色法检测癌细胞活性
将单细胞悬液接种于96孔板，200μl・孔-1，每组设3个复孔。24h细胞完全贴壁后吸出各大孔培养液，加入受试药物，置于培养箱中培养48h以检测各组细胞抑制率，另用同样方法培养0、24、48、72h以绘制细胞生长曲线。实验终止前4h加入MTY液20μl・孔-1(终浓度为5mg・ml-1)，实验结束后倾去药液及培养液，每孔加入150μlDMSO，平板震荡仪震荡10min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔吸光度OD值。然后按下式计算细胞抑制率和生长率：抑制率=(1-实验组平均OD值／对照组平均OD值)×100％，生存率=实验组平均OD值／对照组平均OD值×100％。
1．5 流式细胞术检测各组细胞周期及细胞增殖指数(PI)
各组细胞培养24h后，用0.25％胰酶1-2ml(50ml培养瓶)消化，完全培养液终止消化、吹打后离心，然后加入PBS冲洗、离心，反复2次，获取细胞，细胞浓度高于1×106个・ml-1。将收集的标本荧光素(碘化丙锭)染色20min，用激发波长为488nm，接收波长为575nm的流式细胞仪行细胞周期分析。根据细胞周期分析结果计算PI，PI=(S期细胞数+G2～M期细胞数)／(G0～G1期细胞数+S期细胞数+G2～M期细胞数)×100％。
1．6 免疫细胞化学检测各组细胞核增殖抗原Ki-67表达
将经酸处理的盖玻片放入24孔养板，取对数生长期的细胞消化后接种至24孔板中，细胞悬液浓度为l×105个・ml-1，每孔加入500μl，培养24h，待细胞在盖玻片上贴壁生长后吸去培养液，加入各组受试药物，培养48h取出玻片。PBS冲洗2次浸入冷丙酮中固定10min，每张玻片PBS冲洗3次后加入50μl3％H2O2，室温15min；PBS冲洗3次后加入50μl正常鼠血清工作液，室温30min，将玻片上鼠血清工作液倾去，玻片不洗；加入50μl的一抗(Ki-67抗体)，4℃过夜；PBS冲洗3次后每张玻片加入50μl生物素标记的二抗工作液，37℃孵育30min；PBS冲洗3次后加人50μl辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，37℃孵育30min；冲洗后DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。根据阳性细胞着色面积和着色强度积分，应用Image-pro plus 4.5图像分析软件进行分析，每组选取10个高倍镜视野，用平均光密度值(IOD)表示Ki-67相对表达量。
1．7 统计学处理
所有资料均用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。数据用x±s表示，计量资料的组间比较采用单因素方差分析，P 2 结果
2．1 细胞抑制率及细胞生长曲线
2．1．1 细胞抑制率。rhGH组与对照组、rhGH+NDP组与NDP组、rhGH组内及rhGH+NDP组内比较细胞抑制率和生存率差异均无统计学意义(均P>0.05)；rhGH+NDP组、NDP组与对照组比较细胞生长抑制率明显增加，生存率明显下降(均P0～G1期细胞增殖百分数明显增加，而S期细胞增殖百分数及PI明显下降(P0～G1期细胞增殖百分数明显增加，S期明显降低，PI明显降低(P0.05)。见表2。
2．3 Ki-67表达强度
Ki-67以细胞核呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，以单纯的细胞浆着色而细胞核无着色或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。rhGH组与对照组比较Ki-67表达差异无统计学意义(P>0.05)；rhGH2组与rhGH3组、rhGH2+NDP组与rhGH3+NDP组比较Ki-67表达强度差异亦无统计学意义(P>0.05)；而NDP组、rhGH+NDP组与对照组比较其Ki-67表达强度差异有统计学意义(P2D3水平，增加肠道对钙、磷吸收和增强免疫防御功能。目前rhGH主要应用于侏儒症、慢性肝病、Turner综合征、慢性肾衰、烧伤、大手术后恢复和不育症等方面。恶性肿瘤患者大多存在不同程度的营养不良，晚期常发展成恶病质，全胃肠外营养(TPN)的应用虽然在一定程度上缓解了患者的营养不良状况，但不能使大多数接受抗肿瘤治疗的患者从中获益。而GH作为营养调节剂具有明显的促进蛋白质合成作用，二者合用能迅速纠正负氮平衡，改善营养状况，提高机体的细胞免疫和体液免疫功能，使患者能耐受各种抗肿瘤治疗。
由于rhGH可能会促进肿瘤细胞增殖分裂，使得肿瘤患者能否应用rhGH至今仍存在争议。Snibson等研究发现GH转基因小鼠中高表达的GH通过刺激肿瘤细胞增殖，可协同性地促进致癌物诱导的肝癌形成。Ergun-Longmire等对缺乏GH的肿瘤患儿给予GH治疗，经随访发现，治疗组患者患二次肿瘤的风险高于未治疗组。Fiebig等发现体外实验中生长激素对七种不同人肿瘤细胞(结肠、胃、肺、乳腺、黑色素瘤、卵巢和前列腺癌)无显著的促增殖分裂作用。石毅等研究显示GH对人胰腺癌实体瘤无明显促生长的作用。已有的临床病例分析认为，GH的应用不会增加肿瘤复发或二次肿瘤的危险性，说明肿瘤患者使用GH是安全的。但该类研究大多肿瘤类型单一，随访时间不够长，有待更广泛、长期的临床研究。
Ki-67是全面反映细胞群体活性的良好标记物，它比增殖细胞核抗原(PCNA)更为直接地反映细胞的增殖情况，它可以识别除G0期以外处于其他增殖周期的细胞，用于判断细胞的增殖活性。本实验通过使用免疫细胞化学的方法比较不同组间Ki-67表达差别，间接反映rhGH是否对食管癌细胞具有促增殖作用。
NDP名为顺式-乙醇酸-二氨合铂，是日本盐野义制药公司开发的新一代铂类注射制剂，1995年6月在日本获准上市。它的英文名字为Ne-daplatin，商品名为Nedaplait、Aqupla，因为其易溶于水(aqua)和铂类(platin)化合物而命名。NDP对头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、宫颈癌等均有明显作用，其中对食管癌的有效率超过40％；毒副作用小，胃肠道、肾毒性、耳毒性、神经毒性低；与顺铂、卡铂无完全交叉耐药性。因此，NDP是一种广谱、高效、低毒的新一代铂类抗肿瘤新药。
本实验通过体外药物浓度筛选得出NDP对该细胞株的IC50约为40μg・ml-1。rhGH体外实验的浓度，大多数文献报道用量为50ng・ml-1或100ng・ml-1。根据临床应用状况我们设置了200ng・ml-1次高浓度及400ng・ml-1高浓度组。本研究结果显示，rhGH组与对照组、rhGH+NDP组与NDP组比较在细胞抑制率、细胞周期中各期细胞数量和PI差异及Ki-67表达水平差异均无统计学意义(P>0.D5)，提示rhGH对体外培养的食管癌细胞无促进增殖的作用。
rhGH的作用机制从受体学说来看，GH通过与生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)结合后才能产生各种生物学效应，结合后通过一系列信号通路刺激胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)的合成，从而形成GH-IGF轴。生长激素绝大部分是通过GH-IGF轴发挥作用的，但其本身也可与组织的生长激素受体结合直接产生IGF非依赖的促细胞生长的作用。
众多研究都表明在正常组织和肿瘤组织中，GHR的表达存在着不同程度的异常，这些异常和肿瘤的发生、发展及转移都有着密切关系。另外，GH与催乳素受体(PRLR)关系密切，GHR和PRLR都属于细胞因子受体超家族。GH和PRL有各自的受体，但灵长类动物GH也可以作用于PRLR并发挥作用。因此，在研究GH的作用时很难区分是GHR介导的还是PRLR介导的。
rhGH是否促进肿瘤细胞的增殖分裂及其作用机制现仍存有争议。持肯定观点者认为：(1)rhGH通过局部产生IGF-1直接刺激细胞的分化，间接促进肿瘤细胞的增殖；(2)hGH为肿瘤细胞的增殖提供底物，直接促进肿瘤细胞增殖。持否定观点者认为：(1)hGH增加机体的免疫力；(2)直接或间接产生细胞毒性作用；(3)GH对恶性肿瘤细胞的诱导是通过PRLR的激活，而不是IGF-1受体，而且这种激活作用只对啮齿动物有效，对人无效；(4)肿瘤细胞对IGF-1受体的表达下调。这些均有待进一步的研究证实。
本实验通过体外细胞培养及药物干预研究rhGH对食管癌细胞株的作用，结果提示重组人生长激素在体外无促进食管癌细胞生长的作用，这为肿瘤患者术后应用rhGH-1进行代谢调理和改善不能手术的中晚期肿瘤患者的恶病质以及降低化疗对机体的损伤等提供了一定的参考。
