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摘 要：目的：观察当归补血汤对大鼠永久性局灶性脑缺血的保护作用及对脑源性促红细胞生成素（erythropoietin， EPO）表达的影响。方法：将动物随机分为假手术组、模型组和给药组，采用改良线栓法建立大鼠永久性局灶性脑缺血模型，按缺血时间每组分为4h、1d和7d亚组，给药组灌胃当归补血汤。在缺血相应时间后取材，行甲苯胺蓝染色，观察组织病理变化；行TTC染色，计算脑梗死体积百分比；行FluoroJade B（FJB）染色，计算半暗带阳性细胞数；行EPO免疫荧光染色，计算半暗带阳性细胞数。结果：与模型组相比，当归补血汤可以减轻缺血脑组织的病理改变，降低缺血7d亚组脑梗死体积百分比（P［1］。近年来研究发现，EPO及其受体在中枢神经系统也有表达，它们结合后可以增强神经元的缺血耐受能力，在脑缺血后通过促进血管再生、神经干细胞增殖和分化以及抑制神经元凋亡等途径发挥对缺血脑组织的保护作用［23］。黄芪或当归可以通过促进缺血区血管再生、抗氧化损伤、抑制凋亡等机制对缺血脑组织发挥护作用［56］，但笔者未见文献报道当归补血汤对大鼠局灶性脑缺血的作用及对脑源性EPO的影响。本实验旨在探讨当归补血汤通过脑源性EPO对大鼠永久性局灶性脑缺血的保护作用。�
1 材料与方法�
1.1 动物�
成年雄性SD大鼠，体重250～280g，由军事医学科学院实验动物中心提供（SCXK（军）2002001）。�
1.2 实验药物�
当归补血汤：黄芪、当归两种单味按5∶1的比例水煎浓缩，终浓度为（30g黄芪+6g当归/100ml），4℃保存待用。1.3 试剂及主要仪器�
试剂：TTC（天津光复）、FluoroJade B（FJB）（Chemicon）、羊抗EPO多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IGg、兔抗羊IGg（Santa Cruz），由天津灏洋公司提供。主要仪器：Leica DMRXA2（德国）， Leica CM 1850冷冻切片机（德国）。�
1.4 方法�
1.4.1 动物造模及分组�
采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉永久性局灶缺血模型。动物清醒后观察大鼠的行为特征，以动物清醒后出现左前肢不能伸展和爬行时向左侧转圈并存活至规定时间点作为造模成功。假手术组将线栓插入深度15.0 mm，其余步骤同造模组。45只大鼠随机分为模型组、给药组和假手术组，根据缺血时间又分为4h、1d和7d组。其中，1d和7d组行TTC染色（假手术组n=1，模型组n=4，给药组n=4），其余各时间段用4%多聚甲醛（PFA）灌注取脑（假手术组n=1，模型组n=4，给药组n=4）。给药组造模前3天开始按1ml・kg��-1�・d��-1�灌胃当归补血汤，假手术组和模型组灌胃同等剂量生理盐水。置相同固定液后固定24小时，依次浸入20%、30%蔗糖至沉底，行30μm冠状冰冻切片，1%PFA保存备用（4℃）。�
1.4.2 甲苯胺蓝染色�
甲苯胺蓝染色（56℃）5min，用70%乙醇分化，镜下控制，梯度酒精脱水，常规封片。�
1.4.3 FJB 染色�
50℃干燥10min，置1%氢氧化钠5min。依次置于70%、50%、25%乙醇各5min，0.06%高锰酸钾10min，0.008% FJB 20min（避光），脱水、二甲苯透明，DXP封片，荧光显微镜下用绿色滤镜观察，呈黄绿色为阳性，取半暗带不重叠5个（×400）视野。�
1.4.4 脑梗死体积测量�
脑缺血后1d、7d，迅速断头取脑，从额极间隔�2 mm�连续作6个冠状切片，采用1.5% TTC染色，正常区域呈红色，梗死区域为白色，数码相机拍照后，用图像分析软件测量每张脑片的总面积（S�总）和梗死面积（S��梗死�），利用梗死面积比近似等于梗死体积比的原理，计算脑梗死体积百分比［4］，公式：梗死体积百分比�=∑S��梗死�/∑S��总�。��
1.4.5 免疫荧光染色�
采用漂浮法，置于0.5% Triton X-100 10min，正常兔血清或羊血清封闭真空20min，适当一抗（EPO抗体1：50，HIF1 抗体1∶50）4℃孵育过夜，相应FITC标记的IgG（1∶100）室温真空25min。HIF1 染色后用DAPI（1∶1000）对比染色10min，50%甘油封片，荧光显微镜下观察、取图。�
1.4.6 统计学处理�
FJB和免疫荧光染色后，每张脑片在半暗带随机取5个不重复的（×400）视野。数据采用均值±标准差（�x�±s）表示。组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析，P0.05），但给药组缺血7d脑梗死体积百分比小于模型组2.3 FJB染色�
模型组和给药组皮层、纹状体、海马等区阳性细胞均可见FJB阳性细胞。给药组与模型组缺血4h阳性细胞数无差异，但缺血1d和7d，给药组阳性细胞数均少于模型组（P［3］。Calapaig 等［5］将沙鼠颈动脉结扎再灌注后脑室内注射EPO，发现缺血后脑组织中丙二醛水平降低、CA1神经元丢失减少。Hugo［6］等研究发现，在缺血状态下EPO可以通过JAK2信号通路及VEGF/VEGFR途径促进血管再生。Bernaudin等［7］通过向MCAo大鼠脑室内注射EPO，发现神经干细胞的增殖和分化明显，梗死体积明显减少。TTC染色结果显示，模型组与给药组缺血1d脑梗死体积百分比无差异，但缺血7d给药组的脑梗死百分比小于模型组（P［8］等发现，FJB可使由多种原因引起变性的神经元着色，与TUNEL染色有着良好的相关性，但比TUNEL染色阳性细胞更广泛，FJB染色阳性细胞既包括凋亡神经元又包括坏死神经元。FJB染色结果表明，阳性细胞缺血4h最多，然后逐渐减少，模型组和给药组缺血4h，阳性细胞数无差异，给药组缺血1d、7d阳性细胞均少于模型组。EPO在假手术组中存在一定量的表达，缺血早期模型组与给药组表达量迅速升高，模型组与给药组缺血4h阳性细胞数无差异，但给药组缺血1d、7d阳性细胞数比模型组多（P 本研究利用FJB染色和TTC染色，从细胞和整体水平上验证了当归补血汤对大鼠永久性局灶性脑缺血的保护作用，利用免疫荧光染色的方法观察了脑源性EPO在脑缺血后缺血半暗带内的动态表达情况。结果提示，当归补血汤对缺血脑组织的保护作用可能与增强脑源性 PO表达有关。�
参考文献：�
［1］ 童延清，侯火明. 当归补血汤治疗贫血机制研究进展［J］.江西中医药，2006，37（2）：6263.�
［2］ Wang L， Zhang Zg， Wang Y. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats［J］. Stroke， 2004，（35）：17321737.［3］ Buemi M， Cavallaro E， Floccari F. The pleiotropic effects of erythropoietin in the central nervous system［J］. J Neuropathol Exp Neurol， 2003，（62）：228236.�
［4］ Calapaig， Marciano MC， Corica F. Erythropoietin protects against brain ischemic injury by inhibition of nitricoxide formation［J］. Eur J Pharmacol， 2000， 401（3）：349356.�
［5］ Hugo H. Marti， Myriam B， Edwige P. Neuroprotection and angiogenesis： Dual role of erythropoietin in brain ischemia［J］. News Physiol Sci， 2000， 15（5）：225229.�
［6］ Bernaudin M， Marti HH， Roussel S. A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 1999，（19）：643651.
（责任编辑：杜 靖）��
Effect of Danggui Buxue Tang on Erythropoietin in�
Rats with Permanent FocalCerebral Ischemia�
Liu Qiaofei�1， Feng chao�1， Long Yanyan�1， Feng lin�1， Che Yongzhe��1，2��
（1.Nankai university school of medicine， Tianjin 300071, China;�
2.Key laboratory of bioactive material of Nankai university， Tianjin 300071, China）��
Abstract：Objective：To observe the protective effect of Danggui Buxue Tang （DGBXT） on ischemia brain via brain rooted erythropoietin. Methods： The permanent focal cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO）.45 SD rats were enrolled randomly into three groups， sham group， model group， DGBUDgroup； According to the occlussion time， each group was further divided into 4h， 1d and 7d subgroups. Toluidine blue stain to observe the pathologic change； TTC stain and then calculate the percentage of infarction volume； FluoroJade B（FJB）stain to mark degenerated cells and count the FJB positive cells in the penumbra area； Immunofluorescence stain to detect EPO， count the EPO positive cells in the penumbra area. Results： Contrasted to the model group， DGBXD can reduce the infraction volume in 7d subgroup （P
