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[摘要] 目的：探讨胡桃醌体外抗胰腺癌细胞的机制。方法：采用MTT法检测胡桃醌对BXPC-3细胞的生长抑制作用，流式细胞仪分析胡桃醌对BXPC-3细胞周期的影响。结果：MTT法试验结果显示，胡桃醌对体外培养的人胰腺癌BXPC-3细胞具有明显的生长抑制作用, 24、48 h的IC50值为1.64×10-5、5.8×10-5 mol/L。同时胡桃醌能随着浓度的增加，时间的延长，诱导BXPC-3细胞周期停滞于G2期和S期，呈G2期和S期阻滞作用。结论：胡桃醌对胰腺癌BXPC-3细胞有明显的生长抑制作用，并能阻止其周期，诱导BXPC-3细胞凋亡。
[关键词] 胡桃醌；BXPC-3细胞；细胞周期；细胞凋亡
[中图分类号] R736.7 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）04（a）-０22－０2
Study of juglone on the mechanism of pancreatic cancer cells in vitro
CAO Jun1, LIU Jiansheng 2*
1.Shanxi Medical University, ShanxiProvince, Taiyuan030001, China; 2.Department of General Surgery, the First Hospital of Shanxi Medical University, ShanxiProvince,Taiyuan030001, China
[Abstract] Objective: To investigate juglone against pancreatic cancer cells in vitro mechanism. Methods: Juglone assayon BXPC-3 cell growth inhibition by MTT, analyzed juglone on BXPC-3 cell cycle by flow cytometry. Results: MTT assay shew that juglone inhibited the growth of vitro BXPC-3 human pancreatic cancer cells significantly. The IC50 was respectively 1.64×10-5, 5.8×10-5 mol/L after treatment for 24, 48 h by juglone. As the concentration and time of juglone could increase, induction of BXPC-3 cell cycle arrest in G2 phase and S phase. Conclusion: Juglone significantly inhibited the growth of BXPC-3 cells, and prevent cell cycle and induction apoptosis.
[Key words] Juglone; BXPC-3 cell; Cell cycle; Apoptosis
胰腺癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，是世界上第4位致死性的肿瘤，是一种主要来源于胰腺导管上皮的恶性肿瘤，国内外报道其发病率有明显增高的趋势。胡桃醌（juglone，nuein）又名5-羟基-1，4-奈醌；5-羟基-1，4-奈二酮。是从胡桃揪新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基奈醌类化合物，是胡桃揪中主要的毒性物质。胡桃揪皮为收敛药，对细菌性痢疾，骨结核等[1]有一定疗效。近年有研究表明，胡桃醌可有抗HIV病毒、衣原体、真菌、降血糖等生物活性[2-5]，而且具有抗肿瘤作用，其对肝癌、肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞株和小鼠自发性胃癌[6]有抑制作用，越来越被人们所重视。本实验旨在细胞实验的基础上，研究胡桃醌对胰腺癌细胞的体外抑制及细胞凋亡作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
①人胰腺癌BXPC-3细胞株：购于博士德公司。使用第3~5代对数生长期细胞实验。②胡桃醌：购自sigma。称取胡桃醌3.5 mg，溶于DMSO中，用PBS液稀释成20 mmol/L的胡桃醌母液，-20℃保存备用。
1.2 MTT比色法检测BXPC-3细胞增殖
取对数生长期细胞，制备成BXPC-3单细胞悬液，细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔板内，每孔细胞数为3×103个，于37℃，5％CO2条件下培养24 h后，加入胡桃醌，使其终浓度为0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/ml，均设6个复孔，接种2个96孔板。分别培养24、48 h后MTT检测570 nm下各孔的光密度值OD，以溶剂对照组处理的肿瘤细胞为对照组。计算各浓度药物对细胞增殖的抑制率：细胞抑制率=（对照组平均OD值-加药组平均OD值）/对照组平均OD值×100％。
1.3 流式细胞仪检测细胞周期变化
选用BXPC-3单细胞悬液，并加入胡桃醌后使浓度分别为0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/ml，培养24、48 h后碘化丙啶染色，使用流式细胞仪检测，每份标本1×106个细胞，应用多参数细胞周期分析软件处理，对标本进行细胞周期分析。
1.4 统计学分析
应用软件SPSS 13.0分析。MTT结果以x±s表示。流式细胞仪检测其对细胞周期的影响。
2结果
2.1 胡桃醌对BXPC-3细胞的生长抑制作用
实验表明，胡桃醌在体外对BXPC-3细胞有显著的抑制作用，随着剂量和时间的增加，对细胞的生长抑制率也增加，并呈剂量和时间依赖性。见表1。
2.2 流式细胞术检测胡桃醌作用于胰腺癌BXPC-3细胞后细胞周期的改变
哺乳动物的细胞周期分G1、S、G2、M四期，而胡桃醌可使胰腺癌BXPC-3细胞G2和S期细胞增多，呈现G2期和S期阻滞作用。见表2。
3 讨论
胰腺癌虽然发病率较低，但由于它有高转移的潜能性，外科手术对很多患者已不适用，只能采用放射疗法和化学疗法。胡桃醌为目前己知的唯一的Pin1抑制剂[7]。是从胡桃揪根皮、枝皮、青果皮等分离出来的羟基奈醌类化合物，是胡桃揪的主要毒性物质。近年来的体内外实验显示，其可能对肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌及结直肠癌等多种肿瘤细胞株都具有体外抑制作用。同时有研究表明，胡桃醌可能使人纤维细胞死亡，并表现出一定的细胞毒性[8]。
通过本实验可发现：胡桃醌对胰腺癌BXPC-3细胞有明显的体外生长抑制作用，并呈一定的浓度、时间依赖性。通过MTT法可见，胡桃醌对胰腺癌BXPC-3细胞细胞增殖有明显的抑制，并且细胞存活率降低，随着胡桃醌剂量的增加细胞存活率明显下降。许多抗肿瘤药物都可引起肿瘤细胞的凋亡[9]，各种抗肿瘤药物可能是通过诱导细胞凋亡发挥作用，因此对一种抗肿瘤药物评估的重要指标是细胞凋亡。有研究显示，随着胡桃醌浓度的增加，Bcl-2蛋白的表达反而下降，表明胡桃醌可通过抑制Bcl-2蛋白的表达，改变线粒体膜的通透性[10]，来调节细胞的凋亡[11]；而且还能通过对GSH的消耗，ROS的增多，最终导致细胞凋亡[12]。胡桃醌能剂量依赖性的降低肿瘤细胞的G1期细胞的比例，升高G2期和S期细胞比例，呈G2期和S期阻滞作用，从而阻止周期进程，抑制肿瘤细胞增殖。Kamei等[13]的醌类化合物对细胞生长的抑制试验，发现胡桃醌主要对细胞周期的S期抑制，而化合物中酚羟基的个数越多细胞毒性越大。
目前，关于胡桃醌抑制肿瘤的机制尚未完全阐明，本实验证实了胡桃醌有抑制细胞体外生长作用，并能阻滞胰腺癌BXPC-3细胞周期，诱导细胞凋亡。近年，各种国内外研究显示，多种肿瘤细胞都可被胡桃醌体外抑制，但具体的周期阻滞和诱导凋亡机制有待进一步的研究。
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（收稿日期：2011-02-15）
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