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[摘要] 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)激动剂罗格列酮(ROT)对人子宫肌瘤的增值抑制作用及分子机制。方法 给予原代培养的子宫肌瘤不同浓度的罗格列酮处理,以四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法测定细胞生长抑制率;以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PPARγmRNA 以及凋亡基因Bax、Bcl-2 在子宫肌瘤细胞中的表达及罗格列酮对子宫肌瘤细胞增殖活化的影响。结果 罗格列酮可抑制体外培养的人子宫肌瘤细胞增殖,呈时间和剂量依赖性。RT-PCR 提示罗格列酮可促进PPARγmRNA、Bax表达,抑制Bcl-2表达。结论 过氧化物酶增殖物激活受体激动剂罗格列酮抑制子宫肌瘤的增值可能是通过上调PPARγ、Bax 的表达及下调Bcl-2 的表达来发挥作用的。
[关键词] 过氧化物酶增殖物激活受体γ; 罗格列酮; 子宫肌瘤细胞; 凋亡
[中图分类号] R730 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)09-07-04
Influence of Peroxisome Proliferator-activated Receptor Activator on Human Uterine Leiomyoma Cells
QIN Zhongfang1* LI Meirong2△ LIU Tao1
1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.The First Clinical Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstrct] ObjectiveTo explore the inhibitive effect of a peroxisome proliferator activated receptor -γ(PPARγ) activator rosiglitazone on leiomyoma cell growth and its molecular mechanism. MethodsHuman leimyoma cells in vitro cultured were treated with different concentrations of rosiglitazone,and MTT assay was used to detect the growth inhibition. The semiquantitative RT-PCR method was used to detect the expression of PPARγm RNA,Bax and Bcl-2 and the effect of rosiglitazone on the proliferation and activation of leiomyoma cells. ResultsRosiglitazone inhibited the in vitro cultured human uterine leiomyoma cell proliferation in a time-and dose-dependent manner. The RT-PCR showed that rosiglitazone promoted the expression of the PPARγm RNA and Bax,and at the same time inhibited the expression of Bcl-2.ConclusionThe PPAR-γ activator,rosiglitazone,inhibits the cell proliferation partly through the up-regulation of PPAR-γand Bax and the down-regulation of Bcl-2 expression.
[Key words]Peroxisome proliferators-activated receptorγ; Rosiglitazone; Leiomyoma; Apoptosis
过氧化酶体激活物增殖受体(PPAR)属于配体激活的转录因子,共分三个亚型:PPARα、PPARβ和PPARγ。PPARγ 是当前核受体方面研究的热点,除具有促进脂肪形成及抗炎作用外,还有抑制肿瘤细胞增殖的作用。许多研究结果表明PPARγ 激活后可抑制肿瘤细胞增值及促进细胞凋亡[1]。罗格列酮(Rosiglitazone,ROZ)是PPARγ 的合成配体,目前至少有160 万左右患者服用列酮类药物治疗糖尿病,有必要明确PPARγ 的功能,包括其在肿瘤中所起的作用[2]。国内外已有较多关于PPARγ 抗肿瘤作用的研究报道,但是尚缺乏对子宫肌瘤作用的研究。
子宫肌瘤是女性生殖器官的常见肿瘤,在育龄期妇女中发病率高达20%～30%,是导致女性行子宫切除的重要原因之一。本文旨在研究其激动剂罗格列酮对子宫肌瘤细胞增殖抑制作用,为进一步的临床试验打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
合成培养基含10%灭活胎牛血清(FBS)的DMEM,FBS 购自杭州四季青生物工程有限公司;Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、Trizol 试剂均为美国Sigma 公司产品。TaKaRa RT-PCR 试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(购自GIBCO 公司);引物由上海生物工程公司合成;DAB 显色试剂盒均购自北京中山公司。罗格列酮由中美史克公司生产的马来酸罗格列酮。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 在GenBank 中获得人类基因PPARγ、Bax、Bcl-2 的全长cDNA 序列寻找特异性高的序列区域设计引物。PPARγ 的引物为:上游5"-GCTGTGCAGGAGATCACAGA-3",下游5"-GGGCTCCATAAAGTCACCCAA-3",扩增目的片段长度为225bp。Bax 的引物为:上游5"-TGCTTCAGGGTTTCATCCAGGA- 3",下游5"-ACGGCGGCAATCATCCTCTG-3",扩增目的片段长度为172bp。Bcl-2的引物为:5"-CTTCGCCGAGATGTCCAGCCA-3",下游5"-CGCTCTCCACACACATGACCC-3",扩增目的片段长度为152bp。GAPDH 引物为:上游5"-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3",下游5"-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3",扩增目的片段长度为307bp。
1.2.2 细胞培养及鉴定 收集山西医科大学第一临床医学院妇产科2008年11月~ 2009年2月因子宫肌瘤行子宫手术的病例13例,年龄35～45 岁,术前3个月无类固醇激素使用史,术后均经组织学证实。手术切除子宫后,立即在无菌条件下取每例子宫肌瘤组织1cm×0.5cm×0.5cm置于PBS缓冲液中,密闭尽快送入细胞培养室。将肌瘤组织用4℃PBS 缓冲液反复冲洗并剪碎。吸入离心管内静置,去上清,加入0.1%胶原酶3mL。37℃ 恒温水浴振荡6～7h后加入PBS 终止消化,过滤,1500rpm×10min 离心后,弃上清,加入DMEM 培养液(含10%FBS,青霉素100U/mL,链霉素100U/mL)吹打悬浮后,分别种于50mL培养瓶中,置于37℃、饱和湿度、含5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养。细胞经免疫组化两步法DAB 显色,鉴定为子宫肌瘤细胞。根据细胞生长状态每2～3天传代1次。取生长状态稳定,呈对数生长期细胞用于实验。
1.2.3 形态学观察 用倒置显微镜进行细胞自然生长状态的观察和不同浓度罗格列酮作用于细胞后细胞的形态学变化。
1.2.4 MTT 实验测定细胞生长抑制率 呈对数生长期细胞使用胰蛋白酶消化,制成1×105/mL 单细胞悬液,接种96 孔培养板,每孔100μL(即1×104个细胞),置37℃、5% CO2温箱中培养,24h 后倒置显微镜观察细胞已贴壁生长,分别加入不同浓度罗格列酮,继续培养24、48、72h,实验终止前4h 加入10 MTT 溶液(5mg/mL)20μL,37℃继续孵育4h,中止培养,吸去孔内上清液,每孔加入DMSO 150μL,振荡10min,用酶标仪在490nm 处测定各孔的吸光度A 值。实验设药物处理组、细胞对照组和空白对照组,每种处理重复3 次。罗格列酮终质量浓度分别为10-6、10-7、10-8mol/L。按下列公式计算肿瘤细胞增殖抑制率:肿瘤细胞增殖抑制率(%)=1 -(A 药物处理组-A 空白对照组)/(A 细胞对照组-A 空白对照组)×100%。实验重复3 次,取平均值。
1.2.5 细胞总RNA 的提取和目的片段的扩增 取生长状态稳定,呈对数生长期细胞加入不同浓度罗格列酮,72h 后加入适量Triol,将细胞收入EP 管中。此实验分为空白组、肌瘤加药组(单纯加入罗格列酮,终浓度为10-6、10-7、10-8mol/L),用RNA 提取试剂盒分别提取各组总mRNA 并立即逆转录为cDNA。以10μg 总cDNA 为模板,用上述3对PCR 引物和GAPDH 通用引物分别扩增各个目的片段。产物经琼脂糖凝胶电泳后用图像分析仪进行半定量分析,以各个目的片段与GAPDH 的比值作为其mRNA 的相对表达量。实验重复3 次,取平均值。
1.3 统计学处理
数据用均数±标准差(χ±s)表示,组间差异采用单因素方差分析;两两比较采用SNK-q 检验;用SPSS13.0 统计软件系统进行数据分析。
2 结果
2.1 形态学观察
消化后状态好的子宫肌瘤细胞呈长梭形或椭圆形,在培养24h后观察贴壁良好,48h左右即开始形成细胞克隆,形态呈典型的长梭状。加入不同浓度的罗格列酮后,培养细胞形态发生明显变化,部分贴壁细胞收缩变圆、漂浮。
2.2 罗格列酮对子宫肌瘤细胞增殖抑制的影响
不同浓度罗格列酮(10-6、10-7、10-8mol/L)作用于子宫肌瘤细胞24、48、72h 后,用MTT 法测定对细胞增值抑制率的影响,如图1 所示,相同药物浓度作用72h 肌瘤细胞增值抑制率与24h、48h 肌瘤细胞增值率抑制率比较,P0.05);而在作用48h、72h 不同程度地抑制子宫肌瘤的增值,随着药物浓度的增加,体外培养的子宫肌瘤细胞的增值抑制率增高,各组之间细胞的增值抑制率差异有统计学意义(P [参考文献]
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(收稿日期:2010-01-05)
