【www.zhangdahai.com--可行性研究报告】
邵金华，刘依林，吕敬崑，陈小明,*
1湖南科技学院化学与生物工程学院；
2湖南省银杏工程技术研究中心；
3湖南恒伟药业股份有限公司，永州 425100
假蒟(Pipersarmentosum)别名假蒌、蛤蒟、荜拔子等，隶属胡椒科胡椒属，为多年生、匍匐、逐节生根草本，广泛分布于广东、广西及云南等省份，其作为药食两用植物在我国拥有悠久的使用历史[1，2]。假蒟味辛、性温，具有祛风散寒、行气止痛等功效，以根入药可用于治疗疮肿痈毒、风湿骨痛、跌打损伤和风寒咳嗽等病症[3]，其嫩茎叶在中国南方部分地区被当作蔬菜食用[4]。研究表明，假蒟中含有生物碱、黄酮以及酚类等多种化学成分[5-7]，相应被报道的生物活性有抗炎[8]、抑菌[9]、抗抑郁[10]、抗氧化[11]和神经保护[12]等。
从天然产物中寻找抗菌化合物或组分是抗致病微生物药物发现及应用的重要来源和途径[13]。Yuan等[14]采用生长速率法测试了2 mg/mL的假蒟叶甲醇提取物对香蕉炭疽病菌等9种植物病原真菌的抑制活性，结果显示该浓度下假蒟叶甲醇提取物具有良好的抑菌效果，抑菌率均达50%以上。Zaidan等[15]研究发现，假蒟的甲醇提取液能够有效抑制金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌等致病菌的生长。Liu[16]从假蒟全草70%甲醇提取物中分离鉴定了4个对新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)具有不同程度抑制活性的生物碱类成分。
综上所述，可知假蒟中存在抗菌活性结构成分，以往的研究证实了假蒟所含的生物碱类化合物具有较大的抑菌活性潜力[17]。为了进一步研究假蒟叶中的化学成分及其生物活性，本实验对假蒟叶的总生物碱提取物进行研究，并筛选了所有分离得到化合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，旨在为假蒟植物资源的进一步开发利用提供参考和依据。
1.1 仪器与试剂
GCMS-QP2020 NX单四极杆型气相色谱质谱联用仪(日本岛津公司)；
AVANCE 400 NMR及600 NMR核磁共振仪(德国Bruker公司)；
AVATAR-360傅立叶红外光谱仪(美国Nicolet Instrument Corporation公司)；
Cary 3500紫外可见分光光度计(美国安捷伦公司)；
Waters Breeze2 1525EF分析兼半制备高效液相色谱仪(美国Waters公司)；
RP-18反相柱色谱硅胶和C18色谱柱(5 μm，250 mm × 10 mm；
日本YMC公司)；
柱色谱正向硅胶及硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工有限公司)；
色谱乙腈、甲醇(美国Tedia公司)；
Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(Pharmacia Biotech公司)；
LB培养基(Miller)；
水为超纯水；
所用其他分析纯试剂均为西陇化工股份有限公司产品。
1.2 植物材料
假蒟地上部分于2021年6月采集于云南省西双版纳，由湖南科技学院姜红宇副教授鉴定为胡椒属植物假蒟(Pipersarmentosum)，植物标本(PS-20210612)保存于湖南科技学院“湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室”。
1.3 实验方法
1.3.1 提取与分离
取干燥的假蒟叶5.0 kg，使用中药粉碎机将其粉碎，并用95%乙醇在室温条件下进行渗漉提取，提取液经减压浓缩得到总浸膏(328.5 g)。浸膏加入适量水混悬，用10%的盐酸溶液调节pH值至2～3，氯仿萃取，酸水层用氨水调节pH至9～10，氯仿萃取，萃取液经减压浓缩即得总生物碱部位(10.8 g)。总生物碱部位采用硅胶柱层析脱除色素并进行极性分段，以二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脱，分离得到12个流分(Fr.A～Fr.L)。Fr.G(1.2 g)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱，甲醇洗脱得到7个流分(Fr.G-1～Fr.G-7)。Fr.G-3(320.8 mg)经半制备型HPLC分离纯化(35%乙腈-水，流速2.0 mL/min)得到化合物1(tR= 40.8 min，15.0 mg)和3(tR= 35.0 min，29.8 mg)。Fr.G-5(167.4 mg)经半制备型HPLC分离纯化(35%乙腈-水，流速2.0 mL/min)得到化合物2(tR= 27.4 min，39.5 mg)和4(tR= 42.7 min，11.3 mg)。Fr.H(2.1 g)经反相ODS柱色谱，甲醇-水(35∶65→100∶0)梯度洗脱得到10个流分(Fr.H-1～Fr.H-10)。Fr.H-3(153.5 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)以及半制备型HPLC分离纯化(40%甲醇-水，流速2.0 mL/min)得到化合物6(tR= 38.6 min，10.2 mg)、7(tR= 40.0 min，8.7 mg)和5(tR= 52.6 min，15.0 mg)。
1.3.2 抗菌活性评价
以硫酸卡那霉素为阳性对照，采用微量二倍稀释法[18]测定化合物1～7的最低抑菌浓度(MIC)。使用DMSO溶解化合物，配制浓度为4.0 mg/mL的母液备用。在96孔板第1列、第2列、第3列、第4至12列每孔分别加入200、100、190、100 μL的LB液体培养基，在第3列每孔加入样品10 μL，吹打混匀，再从第3列吸取100 μL至第4列，吹打混匀后，按上述操作依次2倍稀释至第12列，第12列吸取100 μL弃去。使用灭菌后的LB培养基稀释金黄色葡萄球菌液至1×105CFU/mL，除第一列外，每孔加入100 μL稀释菌液，使各化合物终浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39和0.19 μg/mL。将96孔板置于37 ℃恒温箱培养16 h，观察检定菌培养基浑浊度，培养基最澄清的最低药物浓度即为该化合物的MIC。
2.1 结构鉴定
表1 化合物1的氢谱和碳谱数据(600和150 MHz，CD3OD)Table 1 1H and 13C NMR data of compound 1(600 and 150 MHz,CD3OD)
通过对比发现，化合物1与3(chaplupyrrolidone B)的核磁数据较为相似，两者的区别在于C-5位所连取代基团的不同。化合物1比3多出一个连氧亚甲基信号，根据1H-1H COSY谱中δH1.13(3H，t，J= 7.2 Hz，5-OCH2CH3)与δH3.71，3.60(2H，m，5-OCH2CH3)的相关信号确定了乙氧基结构片段的存在，根据HMBC谱中δH6.02(1H，br d，H-5)与δC64.9(5-OCH2CH3)等相关信号确定乙氧基连接在C-5，至此化合物1的平面结构被确定(见图1)。化合物1的旋光值([α]-5.8)显示为负值，通过与文献报道的化合物chaplupyrrolidone A(2)和chaplupyrrolidone B(3)对比ECD谱图、核磁数据以及旋光数据[19]，确定其绝对构型为5S。并将其命名为chaplupyrrolidone C，是1个新的苯丙酰胺类生物碱。化合物1的详细结构鉴定数据原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。
图1 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相关Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1
化合物4无色油状液体(CH3OH)；
HR-ESI-MS：m/z216.103 8 [M+H]+(calcd for C13H14NO2，216.101 9)；
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.30(5H，overlapped，H-5′，H-6′，H-7′，H-8′，H-9′)，7.30(1H，overlapped，H-4)，6.15(1H，dt，J= 6.0，2.0 Hz，H-3)，4.40(2H，t，J= 2.0 Hz，H-5)，3.28(2H，t，J= 7.6 Hz，H-2′)，3.00(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：170.2(C-2)，127.6(C-3)，146.8(C-4)，50.8(C-5)，172.6(C-1′)，38.0(C-2′)，30.2(C-3′)，141.7(C-4′)，128.5(C-5′/9′)，128.7(C-6′/8′)，126.0(C-7′)。以上数据与文献[20]报道基本一致，故鉴定化合物4为sarmentamide A。
化合物5黄色粉末状固体(甲醇)；
HR-ESI-MS：m/z200.105 8 [M+H]+(calcd for C13H14NO，200.107 0)；
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.28(7H，overlapped，H-5′，H-6′，H-7′，H-8′，H-9′，H-2，H-5)，6.26(2H，t，J= 2.4 Hz，H-3，H-4)，3.12-3.10(4H，m，H-2′，H-3′)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：118.8(C-2/5)，113.2(C-3/4)，164.6(C-1′)，36.5(C-2′)，30.2(C-3′)，140.1(C-4′)，128.8(C-5′/9′)，128.3(C-6′/8′)，126.4(C-7′)。以上数据与文献[3]报道基本一致，故鉴定化合物5为N-(3-phenylpropanoyl) pyrrole。
化合物6白色粉末状固体(甲醇)；
HR-ESI-MS：m/z276.123 1(calcd for C15H18NO4，276.123 0)；
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.28(2H，br s，H-2，H-5)，6.43(2H，s，H-5′，H-9′)，6.21(2H，t，J= 2.4 Hz，H-3，H-4)，5.65(7′-OH)，3.80(6H，s，6′-OCH3，8′-OCH3)，3.07(2H，t，J= 7.6 Hz，H-2′)，2.95(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：118.5(C-2/5)，113.0(C-3/4)，169.6(C-1′)，36.4(C-2′)，30.2(C-3′)，131.0(C-4′)，104.8(C-5′/9′)，146.8(C-6′/8′)，133.0(C-7′)，56.0(6′-OCH3，8′-OCH3)。以上数据与文献[3,21]报道基本一致，故鉴定化合物6为3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) propanoylpyrrole。
化合物7白色粉末状固体(甲醇)；
HR-ESI-MS：m/z290.139 5(calcd for C16H20NO4，290.138 7)；
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.31(2H，br s，H-2，H-5)，6.46(2H，s，H-5′，H-9′)，6.28(2H，t，J= 2.4 Hz，H-3，H-4)，3.85(6H，s，6′-OCH3，8′-OCH3)，3.82(3H，s，7′-OCH3)，3.14(2H，m，H-2′)，3.05(2H，m，H-3′)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：118.8(C-2/5)，113.5(C-3/4)，169.7(C-1′)，36.7(C-2′)，30.6(C-3′)，136.2(C-4′)，105.5(C-5′/9′)，153.4(C-6′/8′)，136.1(C-7′)，61.0(7′-OCH3)，55.2(6′-OCH3，8′-OCH3)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定化合物7为3-(3,4,5-trimethoxyphenyl) propanoylpyrrole。
化合物1～7的结构见图2。
图2 化合物1～7的化学结构式Fig.2 The chemical structures of compounds 1-7
2.2 抗菌活性测试结果
采用微量二倍稀释法测定了化合物1～7的最小抑菌浓度，结果如表2所示，化合物1～4对金黄色葡萄球菌具有中等程度的抑制活性，其MIC值在6.25～25 μg/mL之间。化合物5～7对金黄色葡萄球菌无明显抑制活性。
表2 化合物1～7对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度Table 2 MIC of compounds 1-7 against S.aureus
本实验对假蒟叶总生物碱提取物的化学成分及其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性进行研究，共分离鉴定了7个生物碱类化合物。其中，化合物1是一个新的苯丙酰胺类生物碱，化合物7为首次从假蒟中分离得到。采用微量二倍稀释法对分离得到的7个化合物进行了抗菌活性测试，结果表明化合物1～4对金黄色葡萄球菌具有中等程度的抑制活性，由此推测化合物1～4是假蒟发挥体外抑菌活性的重要物质基础之一。本实验开展了假蒟叶化学成分和抗菌活性研究，为假蒟植物资源合理开发利用提供参考依据。
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