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【摘要】目的 建立腺苷原料药中有关物质的高效液相色谱测试方法。 方法采用十八烷基硅烷键合硅胶柱;流动相为硫酸盐缓冲液-叠氮化钠液（1：10000）=60：40；流速为1.5ml/min；紫外检测波长为254nm。 结果腺苷和肌苷峰的分离度R≥9.0，RSD≤2.0%(n=5)；鸟苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤杂质的线性关系良好，线性回归系数为0.998~1.000之间，回收率结果为鸟苷99.2%, 尿苷101.4%, 肌苷100.4%。 结论该检测方法操作简便，结果灵敏、准确，可用于腺苷中有关物质的限度测试。
【关键词】腺苷；高效液相色谱法；有关物质
目前市场上销售的腺苷原料药主要是以发酵工艺制备得到，原料中存在着肌苷、鸟苷等核苷类杂质。经查文献未见有腺苷原料的有关物质检测方法报道。笔者通过实验研究，确定了用HPLC方法检测腺苷有关物质的新方法，能更有效地保证产品质量。
1仪器与试药
1.1仪器USA Waters高效液相色谱仪（Waters 2695型泵，Waters 2487型检测器，SM7型自动进样仪器，Empower pro软件数据处理系统）；AE240型分析天平(瑞士梅特勒公司)
1.2试药腺苷（浙江诚意药业有限公司，批号：20081001、20081002、20081003）；腺苷BP参照品（Batch/lot n01）；鸟苷参照品（lot A011405101）；肌苷参照品（J0310035）；尿苷参照品（lot A014531601）；腺嘌呤BP参照品（Batch/lot n01）。
2 方法与结果
2.1色谱条件C18柱ODS (4. 6mm×250mm ,5μm)；流动相为硫酸盐缓冲液-0.01%叠氮化钠液（60：40，硫酸盐缓冲液配制方法为：精密称取硫酸氢钾约6.8g和硫酸氢四丁基铵约3.4g，同置1000ml容量瓶中，加900ml水溶解，用2M氢氧化钾溶液调节pH至6.5，再加水至刻度，混匀。）；检测波长为254nm；流速为1.5ml/min-1；柱温为30℃；进样量为20μl；运行时间为色谱图记录至腺苷保留时间2倍处。
2.2溶液的配制
2.2.1供试液取腺苷适量，用流动相制备成每1ml中含腺苷约1.0mg的溶液(25mg/25ml)。
2.2.2鸟苷储备液取鸟苷对照品，用流动相制备成每1ml中含鸟苷约10μg的溶液。
2.2.3尿苷储备液取尿苷对照品，用流动相制备成每1ml中含尿苷约10μg的溶液。
2.2.4肌苷储备液取肌苷对照品，用流动相制备成每1ml中含肌苷约10μg的溶液。
2.2.5腺嘌呤储备液取腺嘌呤对照品，用流动相制备成每1ml中含腺嘌呤约20μg的溶液。
2.2.6有关物质混合溶液取腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷、腺嘌呤对照品，用流动相制备成每1ml中约含0.2mg腺苷、0.05mg鸟苷、0.05mg尿苷、0.2mg肌苷、0.05mg腺嘌呤的混合溶液。
2.3方法专属性试验 取2.2.6项下有关物质混合溶液，重复进样（n=5），记录各色谱峰保留时间和峰面积，考察各色谱峰的分离度。理论板数按腺苷峰计算，N≥2000，腺苷峰和肌苷的分离度R≥9.0，重复进样（n=5）RSD≤2.0%，均符合要求。
2.4线性试验
2.4.1取鸟苷、肌苷和尿苷的储备液作线性试验，检测结果表明鸟苷、肌苷和尿苷的浓度与峰面积均呈良好的线性关系，线性回归系数均为1.000。
2.4.2取腺嘌呤储备液作线性试验，检测结果表明腺嘌呤浓度与峰面积呈良好线性关系，线性回归系数为0.998。
2.5精密度试验
2.5.1系统精密度取2.2.6项下有关物质混合溶液，重复进样n=5，记录各色谱峰面积，考察系统重复性。计算主峰峰面积的RSD≤0.2%，符合规定的RSD≤1.0%的标准要求。
2.5.2方法精密度取三批腺苷样品（2008-1001、2008-1002、2008-1003），由二名分析员进行有关物质日间，日内分析精密度试验，其结果均为一致，偏差为0.0%。。
2.6回收率试验取一批已知色谱纯度的腺苷样品，作回收率试验。测得尿苷、鸟苷和肌苷总平均回收率分别为101.4%、99.2%和100.4%，符合规定的95.0%~105.0%标准要求。
2.7流动相中硫酸盐缓冲液比例取有关物质混合溶液考察流动相中含硫酸盐缓冲液不同比例（65%、60%、55%）时色谱体系的适用性，检测结果显示不同比例的缓冲液流动相均能满足测试要求。
3讨论
在中国药典和部颁标准等药品标准中均未见收载腺苷的有关物质检测方法。本实验通过多次摸索研究和试验条件优化，确终筛选确定了以硫酸盐缓冲液-0.01%叠氮化钠液（60：40）作为最佳的流动相，在254nm检测波长处能有效地分离鸟苷、肌苷和尿苷等有关物质，该HPLC方法简便易行，方法精密度高，线性关系良好，回收率满意，重复性好，可作为腺苷有关物质的检测方法和质量控制。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[Z].北京：化学工业出版社，2005:289,608
作者简介：
吕志东，男，（1974-），浙江洞头人，毕业于中国药科大学药学系，执业药师，学士，研究方向：制药
