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【摘 要】目的：以透射电镜观察不同抗痨药物对SD大鼠肝脏超微结构的影响。方法：健康成年SD大鼠（清洁级）152只，体重250～300g，雌雄各半，随机分为8组。观察组：H组：异烟肼（INH H）；R组：：利福平（RFP R）；Z组：吡嗪酰胺（PZA Z）；HR组：异烟肼+利福平；HZ组：异烟肼+吡嗪酰胺；RZ组：利福平+吡嗪酰胺；HRZ组：异烟肼+利福平+吡嗪酰胺。对照组：生理盐水。大鼠用药剂量为人每公斤体重常用剂量的5.5倍。标本制备：每天对各组大鼠进行一次灌胃，10天后处死大鼠，分离肝脏，戊二醛固定后做电镜观察。结果：肝细胞部分线粒体溶解，粗面内质网脱颗粒，滑面内质网池扩张，细胞内脂肪颗粒增多，糖原颗粒显著增多；细胞核周水肿；肝细胞间胶原纤维增生。结论：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺均可引起大鼠肝脏的损害，多种药物联用比单药应用损害更明显；随着药物应用种类的增多，肝脏损害逐渐加重；吡嗪酰胺组比其他单用药组肝脏毒性更大。
【关键词】抗痨药物；透射电镜/超微结构；肝损害/诊断应用
【中图分类号】R54 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0018-04
抗痨药物损害肝脏已有共识，但国内尚未有抗痨药物致肝脏损害行透射电镜观察的文献报道。本实验通过研究抗痨药物对SD大鼠肝细胞超微结构的影响，探索其对肝脏损害的形态学特征。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：SD大鼠152只，体重200～250g，雌雄各半，由河北医科大学动物中心提供。
1.1.2 主要仪器：日立 H-7500透射电镜。
1.1.3 主要试剂：异烟肼（天津力生制药有限公司），利福平（华北制药集团股份有限公司），吡嗪酰胺（成都锦华药业有限公司），戊二醛（天津化工厂出品）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与处理：将SD大鼠随机分为8组，雌雄各半，各组均每日一次性空腹定点灌胃给药。实验组：H组：55mg/kg/d；R组：82.5mg/kg/d；Z组：55mg/kg/d；HR组：INH55mg/kg/d+RFP55mg/kg/d；RZ组：R55mg/kg/d+Z192.5mg/kg/d；HZ组：H55mg/kg/d+Z192.5mg/kg/d；HRZ组：H55mg/kg/d+R55mg/kg/d+Z192.5mg/kg/d。对照组：生理盐水10ml/kg/d。不同组合用药组均为各种单药按前述剂量混合，规律灌喂大鼠10d，动物室具备恒温、清洁、安静等条件。
1.2.2 观察指标及检测方法：①处死大鼠取出肝脏，放入20%甲醛溶液中固定，包埋制成腊块，光镜切片后HE染色。②在光学显微镜下观察，根据病理改变分级，分级方法因国内外尚未有电镜下药物性肝损害分级统一标准，所以本研究根据大鼠肝细胞膜、核膜、细胞质水肿程度，以及线粒体、粗面内质网的破坏程度，次级溶酶体、糖原颗粒、肝细胞间胶原纤维数量多少，将肝损害分成0、I、II、III、IV级，见表1；结果见表2。③切割各大鼠肝组织并迅速戊二醛固定后，由河北医科大学电镜实验中心观察线粒体、内质网等超微结构变化情况。肝损害电镜结果见表3。
1.3 统计学方法：采用SAS6.12统计学软件。计数资料病理分级后，组间比较用χ2及秩和检验。
2 结果
2.1 肝组织损害光镜病理分级在各实验组中的对比分析，见表2。
2.2 由表2可以看出HR组、HZ组、RZ组 、HRZ组与单药组比较肝脏损害明显。单用药组光镜下：肝细胞胞质疏松、浊肿、核仁增多及呈颗粒状。电镜下表现为肝细胞核轻度畸形、核周水肿、糖原增多，线粒体轻度水肿、嵴大部消失、膜全部或部分消失，高尔基复合体较正常，次级溶酶体、粗面内质网脱颗粒，滑面内质网池扩张，细胞器之间轻度水肿、糖原颗粒增多，肝细胞间胶原纤维轻度增多呈束状。其中PZA组尤为严重。合用药组光镜下不仅上述表现加重，尚可见肝小叶排列不齐；电镜下表现为粗面内质网膜旁核糖体脱颗粒现象；糖原增多，线粒体髓样变；肝细胞之间胶原纤维增生，可见红细胞和淋巴细胞。显示合用药组较单用药组肝细胞损害更严重。
3 讨论
异烟肼、利福平、吡嗪酰胺是世界卫生组织推荐的标准抗结核化疗方案中的一线药物，对细胞内外、繁殖期和静止期状态的细菌均有较强杀灭作用。随着抗结核化疗疗程的推移，由抗结核药物所造成的不良反应也相应增加，其中以肝脏毒性反应最为显著[1]。我们知道包括醛基（MDA）在内的脂质过氧化物、超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O-2）保护细胞免受损伤；谷胱甘肽（GSH）是一种低分子清除剂，它可清除O-2。缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用或加重其中毒作用，这可能与增加氧化损伤有关，因而GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素[2]。异烟肼、利福平等在肝内经P-450还原后，还产生亲电子基、自由基、氧基等毒性代谢产物。与蛋白、核酸等大分子物质结合或造成脂质过氧化。破坏肝细胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使细胞内外环境Ca2+的稳态被破坏，致肝细胞凋亡[3]。我们成功地建立了大鼠抗结核药物肝脏损害的模型，观测了单药组与组合用药组，不同药物组大鼠肝组织损害病理表现程度不同，在此探讨抗结核药物致肝脏损害病理表现与不同抗痨药物的关系。
药物性肝损害是抗结核药物最常见的毒副作用之一，也是结核病人停止化疗的最常见原因之一，近年来抗结核药所致肝损害似有上升趋势。查月芳等人的实验[2]看到，INH和RFP合用或三种药合用或PZA组单用肝组织脂质过氧化产物MDA的含量增高，SOD活性、GSH含量下降有统计学差异，说明INH和RFP合用或三种药合用及PZA单用组对大鼠肝脏损伤，与脂质过氧化物相关，与本实验大鼠肝组织病理表现基本相吻合。我们通过动物实验发现抗结核药物致肝损伤病理表现与病毒性肝炎相似，为弥漫性肝实质损伤，包括肝细胞的点状坏死、桥接坏死或多小叶坏死，门脉及门脉周围单核细胞浸润，肝细胞水肿、脂变、坏死及炎细胞浸润[4-5]。据文献统计INH、RFP合用有35%的人可出现转氨酶升高，而单用INH仅为10%；联合治疗方案中有INH没有RFP肝损害发生率为1.6%，有RFP没有INH肝损害发生率为1.1%；两药合用时，成人肝损害为2.7%，儿童为6.9%。所以当用HRZS或HRZE方案出现肝脏损害时，停用INH或RFP均可缓解肝损害，使治疗方案继续下去。临床应用抗结核药物时，RFP所致的胃肠道反应、过敏性反应，如恶心呕吐、皮疹、血卟啉病、流感、狼疮、血小板减少性紫癜、哮喘、过敏性休克、肝衰等[5]比INH、PZA更常见，常片面地认为RFP在三药中肝脏毒性最大；但从本实验来看，RFP致肝脏损害程度病理表现较PZA为轻，其原因可能是肝药酶诱导活性增高，本身排泄；王乃平等曾研究RFP对CCl4所致小鼠急性肝中毒影响，发现经RFP预处理过的小鼠在给予CCl4后，其血清ALT水平显著低于对照组（P<0.01）；组织病理也发现肝损害程度轻于未用RFP预处理小鼠的对照组；检测肝脏微粒体膜发现RFP可以稳定小鼠肝脏微粒体膜，RFP可引起胆汁瘀积性肝损伤，因其可竞争性抑制胆红素排泄，同时可引起变态反应性肝损伤，但有明显个体差异。PZA的半衰期为9～10h，较INH、RFP的1～2h长，蛋白结合率为50%，每日总量3g口服后有15%出现肝脏症状，其中2%～3%出现黄疸，极少数有肝坏死。本实验PZA组与两药合用组的病理表现相同，说明损害程度相当，在电镜下亦证实合用药组肝细胞间纤维增生，在单用药组中未出现而在HZ组中出现，亦说明PZA肝脏毒性相当大，所以PZA组的肝脏毒性在临床用药中应受到重视。。临床可在应用抗结核药物的同时加用护肝药物，以保证抗结核进行下去。
图1为HZ组：部分细胞核及胶原纤维，线粒体轻度改变（5.0KX）。
Figure 1 is HZ Group：some karyon and collagenous fibers，mitochondrion change slightly（5.0 KX）.
图2为HRZ组：线粒体水肿，部分嵴排列紊乱、消失、部分内外膜融合或消失，粗面内质网膜旁核糖体有脱颗粒现象（20KX）。
Figure 2 is HRZ Group：Mitochondrion dropsy，the lines of some cristae foul up，disappear，some membrane inside and outside amalgamate or disappear，some particles of the ribosome beside the rough surfaced endoplasmic reticulum fell off.（20 KX）.
图3为HRZ组：肝细胞之间可见两束增生的胶原纤维（15KX）。
Figure 3 is HRZ Group： Two bundle of hyperplastic collagenous fibers between the liver cells can be seen（15 KX）.
图4为PZA组： 肝细胞间胶原纤维增生成束状（横切面），糖原颗粒增多（20KX）。
Figure 4 is PZA Group：Collagenous fibers between the liver cells form the shape of bundles（transverse section）.Particles of hepatin manifold（20 KX）.
图5利福平组： 糖原颗粒增多，颗粒之间水肿，核膜轻度畸形，部分核膜内外层融合或消失，线粒体部分膜消失，部分嵴消失，糖原颗粒增多、细胞质水肿；粗面内质网有脱颗粒现象（20KX）。
Figure 5 is Rifampin Group：the particle of heptin manifold，dropsy between the particles，membrane of the karyon is slightly freakish，some of the inside
and outside layer of the karyon membrane amalgamate or disappear，some of the motochondrion"s membrane disappear，some cristae disappear，hepatin particles marifold，cytoplasm dropsy；some particles of the rough surfaced endoplasmic reticulum fell off.（20KX）.
图6利福平组： 细胞质内可见包含脂肪滴、胶原纤维（10KX）。
Figure 6 is Rifampin Group：Fat dripping and collagenous fibers can be seen in the cytoplasm（10KX）。
图7为RZ组：线粒体水肿、大部分嵴消失、部分膜消失，核膜部分消失，核周可见大量粗面内质网（20KX）。
Figure 7 is RZ Group：mitochondrion dropsy，most of the cristae disappear，some of the membrane disappear，some of the karyon membrane disappear，many rough surfaced endoplasmic reticulum can be seen around the karyon.（20KX）。
图8为RZ组：核旁糖原增多、糖原之间水肿，线粒体水肿、大部分嵴消失、膜部分融合、破裂（20KX）。
Figure 8 is RZ Group：Hepatin beside the karyon manifold，there are dropsy between the hepatins ，mitochondrion dropsy.most cristae disappear，some membrane amalgamate ，breach.（20KX）。
图9为PZA组：细胞质轻度水肿，糖原颗粒增多（2.5KX）。
Figure 9 is PZA Group：cytoplasm slightly dropsy，hepatin particles manifold（2.5 KX）.
图10为PZA组：线粒体轻度水肿、嵴大部分消失；可见次级溶酶体、粗面内质网脱颗粒；细胞器之间轻度水肿、糖原颗粒增多；胶原纤维增多（20KX）。
Figure 10 is PZA Group：mitochondrion slightly dropsy，most of the cristae disappear，primary lysosome and the particles of the rough surfaced endoplasmic reticulum can be seen；there are slight dropsy between the cells，the hepatin particles manifold，collagenous fibers manifold.（20 KX）.
图11为RZ组：细胞器之间高度水肿，细胞器散在、糖原散在（7.0KX）。
Figure 11 is RZ Group：there are serious dropsy between the cell organs ，the cell organs scatter and the hepatin scatter （7.0 KX）.
图12为RZ组：线粒体变性、嵴部分消失、局部水肿、膜部分消失、轻度髓样变、两层膜融合、模糊（20KX）。
Figure 12 is RZ Group：Motochondrion denaturalization，some cristae disappear，some part dropsy，some membrane disappear，marrow slightly change，the membrane"s two layers amalgamation，were blurred（20KX）.
参考文献：
[1] 张炜平. 抗结核药所致肝损害的临床观察. 临床肺科杂志，2003，8（1）：82
[2] 查月芳，张广宇，李志惠，等. 抗结核药物的肝损害与脂质过氧化反应的关系. 河北医药，2004，26（4）：689
[3] 程书权，侯淑君，孔淑敏. 抗结核药物致肝损害172例临床分析. 中华全科医师杂志，2005，4（6）：10
[4] 李勇朴，余纪会. 抗结核药物致肝损害临床分析. 临床药学，2004，13（3）：73
[5] 孙翠芬，李净，华来庆，等. 结核病人药物性肝损害影响因素分析. 江苏医药杂志，2004，30（5）：949
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