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摘要[目的]在昆虫S2细胞中重组表达斑马鱼IL10蛋白。[方法]PCR扩增斑马鱼IL10蛋白编码基因，连接到分泌表达载体pMT/Bip/V5-His A中与辅助质粒pCoBlast共转染S2昆虫胚胎细胞，通过Blasticidin加压筛选，获得稳定表达斑马鱼IL10的细胞系。用硫酸铜诱导IL10蛋白表达，收集无血清的细胞表达上清，采用SDSPAGE及Western鉴定目的蛋白。[结果]目的蛋白在昆虫细胞中获得表达，SDSPAGE结果表明相对分子质量为23 kD，与预期结果相一致。[结论]获得了重组斑马魚IL10蛋白，为进一步在蛋白水平上研究其功能和调控机制奠定了基础。
关键词斑马鱼；IL10蛋白；S2细胞；真核表达
中图分类号S965.119文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07769-04
作者简介娄婧婧（1986- ），女，湖南长沙人，研究实习员，硕士，从事食品安全生物学研究。
收稿日期20140710细胞因子由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生，能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥功能，是高活性功能的多肽、蛋白质或糖蛋白。细胞因子及其构成的网络在免疫调节方面起着重要。白细胞介素10（IL10）是一种细胞因子，主要由Th2细胞产生，是能抑制Th1细胞释放细胞因子（IFNγ和IL2等）的免疫调节性细胞因子[1]。研究表明，IL10能抑制炎症介质因子的分泌，是非常有效的抗炎介质，在体液免疫中起重要作用[2]。动物和人体的各种体内研究表明，IL10治疗可以降低炎症的严重程度[3]。
在人类和鱼类的基因组中，IL10基因的大小大约为2 kb。第1个外显子编码信号肽和A螺旋结构。第2个外显子编码AB鲁普结构和B螺旋结构。第3个外显子编码C和D螺旋结构。第4个外显子编码DE鲁普结构和E螺旋结构。第5个外显子编码F螺旋和羧基端的尾巴以及1个不翻译的包括AUUUA的片段，当这个片段与AUF1结合时，会降低IL10mRNA的稳定性[4]。
鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus， ISKNV）是近年来广东鳜鱼养殖业爆发性流行病的主要病因之一，造成了巨大的经济损失。ISKNV以鳜鱼脾和肾为主要侵入组织，引起脾肾细胞的肿大和坏死。近年来，越来越多的学者通过研究ISKNV病毒作用机制来探讨鱼类天然免疫机制。国内研究表明，ISKNV感染斑马鱼后斑马鱼体内的IL10含量迅速升高[5]。据此推测，IL10参与了鱼类的免疫调节，但其作用机制有待进一步研究。为此，笔者构建了斑马鱼IL10基因真核表达载体，融合表达并纯化了IL10蛋白，以期为进一步的生物学功能研究奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验材料大肠杆菌 DH5α感受态细胞由实验室保存；真核表达载体pMT/Bip/V5-His A购自英俊公司，PCR胶回收、质粒提取试剂盒购自Omega公司；DNA Marker、限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 连接酶、高保真DNA聚合酶均购自TaKaRa 公司；Schneider’s Drosophila Medium和FBS、Cellfectin转染试剂均购自Invitrogen公司；antiV5 antibody购自Sigma公司；低分子量标准蛋白购自大连宝生物公司；其他试剂均为国产分析纯试剂，购自威佳公司。
1.2斑马鱼IL10基因真核表达载体的构建从斑马鱼脾脏组织中提取RNA反转录成cDNA，以此cDNA为模板，结合真核表达载体pMT/Bip/V5-His A的多克隆位点和IL10基因的限制性酶切位点，根据NCBI网站上斑马鱼IL10基因的编码序列，利用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物。在上下游引物的5’端分别加上KpnⅠ和XholⅠ的酶切位点，引物序列为：DIL10PF： 5’ GGGGTACCcAGGAGAGTCGAATGCAAAAC 3’；DIL10PR： 5’ CCGCTCGAGGTGCTTAACCCTCTTTGAG 3’。
PCR反应体系包括0.5 μmol/L 正向/反向引物、2 ng cDNA 模板、dNTP 混合液各2.5 mmol/L、缓冲液（添加Mg2+）、Kodplus DNA 聚合酶0.025 U，用灭菌三蒸水补齐至50 μl。PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s 30个循环；72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用试剂盒回收目的片段的扩增产物。分别用XhoⅠ和KpnI双酶切纯化产物和真核表达载pMT/Bip/V5-His A，回收双酶切片段，T4 DNA 连接酶16 ℃连接过夜，构建pMT/Bip/V5-His A-IL10的真核表达质粒，转化大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆37 ℃振荡培养，菌液PCR筛选阳性克隆后测序[6]。引物合成和测序均由上海英俊生物工程有限公司完成。
1.3IL10蛋白的真核表达及稳定细胞系的筛选用试剂盒提取测序验证无误的目的重组菌的无内毒素质粒待用。取无血清SDM培养基培养的S2单层细胞转板后培养待其贴壁生长并达到一定密度后，将无内毒素质粒及Cellfectin转染细胞，28 ℃下培养18 h，弃去旧培养液，加入含10%FBS的培养基（添加双抗）继续培养。转染后的细胞培养约3～5 d，待其生长到分裂期，将原培养基换成添加抗生素（Blasticidin）的10%FBS的SDM培养基继续培养，筛选稳定表达的细胞系。筛选细胞过程中约4～5 d换液1次，筛选14 d后开始扩大培养。在转染后筛选细胞前和筛选细胞并扩大培养后，分别用硫酸铜诱导蛋白表达。在培养基中加入500 μg/ml的硫酸铜，将细胞置于28 ℃条件下继续培养。
1.4IL10蛋白的纯化取筛选后诱导的细胞，在诱导后第4天开始收集细胞上清，将上述滤液过Ni2+金属螯合层析柱，用Novagen公司的His.Bind 纯化试剂盒，通过镍螯合层析纯化His-Tag 融合蛋白。用含不同浓度咪唑（60和120 mmol/L）的洗脱缓冲液（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，6 mol/L尿素，pH8.0）梯度洗脱后，进行SDS-PAGE蛋白检测。
1.5IL10蛋白的检测及Western blotting分析按照常规方法处理样品进行SDSPAGE，检测蛋白的表达情况。Western blot分析，将SDS-PAGE凝胶上的条带转移到硝酸纤维素膜上，用50 g/L脱脂乳封闭，用antiV5 抗体作为一抗，以1∶5 000倍稀释的羊抗兔IgG（碱性磷酸酶标记）作为二抗，经NBT/BCIP显色，观察特异性条带[7]。
2结果与分析
2.1IL10基因的PCR扩增以提取斑马鱼脾脏组织RNA反转录的cDNA作为模板，利用设计的上游引物PF和下游引物PR进行扩增，产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳可见清晰的目的片断扩增条带，条带大小为474 bp与设计长度相符，且未出现其余杂带，扩增的特异性良好。
2.2 pMT/Bip/V5His AIL10的真核表达质粒的酶切鉴定从可以看出，酶切后产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳可见2条清晰条带，1条为pMT/Bip/V5His A载体条带3.6 kb，另1条为IL10基因目的片段（474 kb），证明pMT/Bip/V5His AIL10真核表达载体构建成功，测序验证目的片段序列也与IL10的序列相符。
注：M.DL1000 Marker；1.PCR扩增产物。
IL10基因的PCR扩增结果注：M.DL1000 Marker；1.阳性克隆的产物。
重组质粒的双酶切鉴定2.3筛选稳定表达的细胞系培养S2细胞待其生长良好贴壁达到一定密度后拍照，转染细胞后与筛选初期和后期分别拍照。发出荧光的细胞均为成功转染的细胞。从中可以看出，细胞转染效率较高；加压筛选后，荧光细胞的密度显著增大。
注：A.正常生长的S2细胞；B.转染后未经筛选的S2细胞；C.加压筛选后的细胞。
S2转染细胞的筛选结果2.4细胞表达上清的SDSPAGE及 Western blot鉴定从可以看出，纯化前细胞上清的电泳条带中可见目的条带和杂带；纯化后23 kD处出现清晰的条带，大小与重组IL10蛋白相符；经Western blot后，在纤维素膜的预期位置出现特异性条带，进一步验证了细胞表达的正确性。
3讨论
3.1斑马鱼IL10基因的序列分析几种脊椎动物的IL10基因已经被克隆出来，比如人、老鼠、鸟类和鱼类。结果表明，鱼类IL10的表达模式与哺乳动物不同，鱼类中不同种类的鱼的表达模式也不同。斑马鱼的IL10氨基酸序列与其他已知的IL10氨基酸序列相似度为29.7%～80.9%，斑马鱼和普通草鱼的相似度最高，达到80.9%[2]。国外的研究表明，IL10基因在同一家族的鱼中是高度保守的。
3.2斑马鱼IL10基因的真核表达果蝇胚胎细胞表达系统（Drosophila Schneider 2 cell expression system）是一个高效表达外源蛋白的系统，该系统因表达质粒的不同分为组成性表达和分泌型表达，稳定表达细胞系的的筛选过程是在筛选压力下将外源基因整合到果蝇基因组中的过程。分泌蛋白注：M.标准蛋白Marker ；1.纯化前；2.纯化后；3.Western blot结果。
细胞上清的SDSPAGE及Western鉴定42卷23期娄婧婧等重组斑马鱼IL10蛋白的真核表达几种已知IL10氨基酸序列的比较的表达是在金属硫蛋白（MT）的控制下的，在锌、铜、锰、铁、钼等金属离子的诱导下，该系统可启动高效的外源蛋白表达[8-10]。
果蝇S2表达系统具有许多其他表达系统所无法比拟的优越性。首先，许多种类的载体都可以在S2细胞中表达目的重组蛋白，选择pMT/Bip/V5His A载体是因为IL10是分泌到细胞外的蛋白，而pMT/Bip/V5His载体包括果蝇细胞分泌信号，可诱导表达分泌目的蛋白[11]。其次，此系统为真核表达系统，可以对目的蛋白进行真核表达系统的修饰。由于该试验的研究对象是斑马鱼，使用真核表达系统来表达IL10就比使用原核表达系统更好，更适用于斑马鱼的研究。再次，此表达系统能在半个月获得稳定表达目的蛋白的细胞系，比起其他真核表达系统耗时较短。国内已有人已经成功运用这个表达系统获得了干扰素有活性的蛋白，且表达的蛋白量大约为1 ml上清中有2 μg目的蛋白[12]，因此通过这一表达系统便于获取有活性的斑马鱼IL10蛋白，为进一步研究奠定了基础。
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