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釉基质蛋白在生物牙齿发育过程中充当了矿化的有机支架，对羟基磷灰石晶体的沉积和形成至关重要，其中釉原蛋白是釉基质蛋白的一种，占釉基质蛋白含量约90%。研究表明釉基质蛋白对特定细胞类型、炎症介质、牙龈组织血管的生成、口腔伤口愈合都有着不同层度的影响。目前唯一获得FDA认证并且应用于临床的釉基质蛋白是瑞典Biora开发猪源性釉基质蛋白药物Emdogain，它是由猪源性釉基质蛋白（EMD）和丙二醇藻酸酯（PGA）组成，外观呈现凝胶状的物质。Emdogain已经应用于临床治疗牙周疾病20多年，但随着口腔疾病越来越复杂，传统的PGA载体已不能满足临床治疗的需求，如自身的机械强度不足，在牙周组织释放浓度波动大、不能在伤口提供良好的成型条件、治疗后需要服用抗生素抑制细菌感染牙周伤口。
有研究研发聚乙二醇和可降解聚酯组成的ABA型三嵌段共聚物（PCLA-PEG-PCLA）凝胶负载人重组釉原蛋白可促进hPDLFs的增殖并上调成骨相关基因的表达。有学者采用层层自组装技术对聚己内酯纺丝膜的表面进行修饰，构建出一种能够控制EMPs释放的纳米涂层修饰的聚己内酯纺丝膜。目前的问题是许多载体的特性并不能满足釉基质蛋白在实际应用中的情况，其中载体的表征与生物相容性是非常重要的标准。许多研究已报道CS 能提供良好的抗菌活性、生物相容性、生物降解性、温度敏感特性和可逆凝胶化性质。但以CS为载体负载rhAm的抗菌效果如何，表征是否适合负载釉基质蛋白应用于牙周治疗，对比传统的PGA载体在生物相容性上是否具有优势目前尚不清楚。
(4)水体的悬浮颗粒物粒径不同，其相应的光谱特征也有所差异[18-19]，水体粒径垂直变化对水体遥感反射率有一定的影响[20-21]，如果不考虑其垂直变化，卫星遥感反演悬浮颗粒物粒径将会引起较大误差，掌握湖泊悬浮颗粒物粒径的时空分布可为卫星遥感监测水体信息提拱技术支持。
因此，本研究评价以CS为基础的新型温敏性载体和传统PGA载体分别负载rhAm在表征、抗菌效果和生物相容性上的测试效果。
1.1 主要试剂
壳聚糖（脱乙酰度≥95%，aladdin）；
丙二醇藻酸酯（PGA，百思特）；
β-甘油磷酸钠（麦克林）；
溶菌酶（索莱宝）；
胎牛血清（Gibco）；
DMEM培养基（Gibco）；
CCK8（Sigma-Aldrich）；
青霉素－链霉素双抗（Gibco）；
SYBR QPCR Master Mix（Takara）；
抗体：RUNX2（联科生物）、Collagen I（Abcam）、β-catenin（Santa Cruz）、Ki67（BD bioscienes）、CyclinD1（CST）、β-actin、GAPDH（bioworld）；
BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（碧云天）。
1.2 实验方法
1.2.1 材料的制备 称取1.0 g CS粉末溶于45 mL乙酸溶液（0.1 mol/L），室温下搅拌2 h，高压蒸汽灭菌。配制0.6 g/mL的βGP溶液，滤膜过滤除菌。在低温条件下，在CS搅拌过程中逐滴加入βGP溶液并继续搅拌15 min。低温下加入rhAm至终浓度为20 μg/mL得到CS-βGP-rhAm凝胶。取3.3 g PGA溶于去离子水并定容至100 mL，高压蒸汽灭菌，冷却后加入rhAm搅拌均匀得到PGA-rhAm。
1.2.6 细胞培养和实验分组 hPDLFs（上海斯信生物），培养条件为含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的DMEM，37 ℃培养箱培养。
1.2.3 溶胀率、pH值、凝固时间和相变动力学曲线测定分别取6%、8%、10%βGP制备的CS-βGP-rhAm于70 ℃真空干燥箱内干燥24 h后称重（M），然后在蒸馏水中静置48 h充分溶胀，用滤纸吸去表面的水分后称重（M）。膜的溶胀率（Esw）＝（M-M）/M×100%。
1.2.4 体外降解率和缓释率测定 分别取6%、8%、10%βGP 制备的CS-βGP-rhAm，称量后加入pH 为7.0 的PBS，37 ℃摇床中缓慢振荡，然后每隔1 d（共14 d）取100 μL的溶液，并补加100 μL的PBS。使用BCA试剂盒测定各个时间点的蛋白浓度，计算各时间点的累积药物缓释量。取以上组别的凝胶放入20 mL含10U/L溶菌酶和pH值为7.0的PBS缓冲液中，在37 ℃恒温振荡培养箱中以100 r/min连续摇动，每2 d更换缓冲液。在预定时间点称重并计算降解率。
采用倒置法观察4%、6%、8%、10%βGP制备的CSβGP-rhAm温敏特性，在37 ℃恒温水浴箱中，每隔1 min取出玻璃瓶并倒置观察凝胶的流动性，倒置15 s凝胶不流动的时间点计为凝固时间。
环境温度对矿化垃圾反应床稳态运行性能具有较大影响，主要表现在影响污染物去除性能及床体水力渗透性能2个方面。
本文以CGDPA为基准,采用定量指标评价IMERG终级产品的精度,包括相关系数ICC、均方根误差IRMSE和相对偏差IRB,计算方法如下:
1.2.5 抗菌实验 将金黄色葡萄球菌悬浮液调整至1×10CFU/mL，将6.0%βGP交联制备的CS-βGP、CS-βGPrhAm 分别以体积比1∶30 与悬浮液混合，3.3%PGA、3.3%PGA-rhAm 分别以体积比1∶55与悬浮液混合，rhAm溶液与悬浮液混合至终浓度为20 μg/mL，实验分为Control组、CS-βGP-rhAm组、CS-βGP组、PGA-rhAm组、PGA组，各组培养反应30 min，然后进行涂布实验、细菌培养和平板菌落计数。
1.2.2 黏度测试 黏度计选择合适的转头，在适当的转速下测试不同浓度PGA的黏度值。
（2）本文应该相应的指数测算方法，从贸易竞争性和互补性两个方面，对中约两国经贸合作程度进行测算。结果显示，中约两国的贸易竞争性较弱，出口商品的差异化明显，但是两国贸易联系不断增强；
在贸易互补性方面，中方出口约地方的贸易互补性表现较弱，相反，约方出口中方的贸易互补性相对较强。“一带一路”倡议的有效实施定会拓宽两国的经贸合作领域，进而加强两国经贸联系度。
1.2.7 细胞增殖、划痕实验 将hPDLFs细胞（4×10/mL）添加到96孔板中，细胞贴壁后分别加入每组配制好的溶液，实验分为Control组、CS-βGP-rhAm组、CS-βGP组、PGA-rhAm组、PGA组，每组5个复孔，放入培养箱培养1 d、2 d、3 d。避光加入WST-8 溶液后在恒温培养箱中孵育2 h，使用酶标仪测量吸光值。
将CS-βGP-rhAm、CS-βGP 在37 ℃下凝固后以0.1 g/mL的浓度使用DMEM无菌浸泡获得浸取液。将3.3%PGA、3.3%PGA-rhAm 加入DMEM 培养基使其PGA终浓度达到0.4 mg/mL。将每一组溶液测定rhAm的浓度，配制相应浓度rhAm作为单独实验组。
将hPDLFs细胞（2.5×10/mL）添加到6孔板中，当细胞接近100%汇合时，使用200 μL枪头划痕，完成划痕后用1×PBS洗去漂浮细胞，分别加入每组配制好的溶液，实验分为Control组、CS-βGP-rhAm组、CS-βGP组、PGA-rhAm组、PGA组。48 h后显微镜拍下细胞迁移情况，imge J分析划痕面积（0 h面积为A，48 h面积为B）。迁移率=[(A-B)/A]×100%。
CS、CS-βGP、CS-βGP-rhAm置于37 ℃恒温水浴锅，每隔1 min在分光光度计测定450 nm的吸光值，绘制相变动力学曲线并测定相应pH值。
1.2.8 蛋白印迹分析检测 按照说明书利用RIPA提取蛋白，BCA测定蛋白浓度，将定量样品在SDS-PAGE凝胶中上样、电泳分离蛋白，转印至NC膜，5%BSA封闭1 h。加入相应I抗CyclinD1（1∶1000）、Ki67（1∶500）、RUNX2（1∶1000）、Collagen I（1∶2000）、β-catenin（1∶500）、GAPDH（1∶2000）、β-actin（1∶2000），4 ℃孵育过夜，洗膜3次，按1∶8000稀释Ⅱ抗，孵育1 h。ECL化学发光后使用凝胶成像系统拍照，Image J分析结果。
1.2.9 实时定量PCR检测 根据Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，利用分光光度计测试RNA的A260/280，在1.8～2.0的样品可用于反转录合成cDNA，qPCR以管家基因GAPDH为内参，结果以2法进行分析，各引物序列（表1）。
1.2.10 碱性磷酸酶（ALP）染色 室温下使用4%多聚甲醛适当固定细胞，用1×PBS洗涤细胞3次，去除洗涤液后加入适量BCIP/NBT染色工作液。室温避光孵育12 h，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色应，将样品置于显微镜进行拍照。
1.3 统计学处理
利用GraphPad prism8.0软件分析实验结果，定量资料以均数±标准差表示，两组间比较使用检验，多组比较则采用单因素方差分析，＜0.05为差异具有统计学意义。
那道白光如天空中滑落的电，挂着尖锐的破空声，准确地插入了土狼王张开的大口中。他听到土狼王的筋肉在白光的冲击和挤压下，传出败革一般的“扑扑”声，又听到包裹在筋肉内的骨头，在与白光的碰撞和摩擦中，发出“咔咔”的碎裂声。然后，白光停在了土狼王的体内。
2.1 PGA-rhAm制备和黏度测试
鉴于临床制剂黏度和猪源性釉基质蛋白药物Emdogain黏度度值约为3.0～4.0 Pa·s，本研究医用PGA的浓度与黏度值呈正相关，在3.3%、3.4%PGA浓度下能够达到3.054±0.0263 Pa·s、3.463±0.0458 Pa·s，当以3.3%PGA结合rhAm的时候能够保持3.262±0.055 Pa·s（图1A、B）。
由表4可知，42个待评价水样中Ⅰ类水质样本数为7个，占总数量的16.67%；
Ⅱ类水质样本数为11个，占总数量的26.19%；
Ⅲ类水质样本数为8个，占总数量的19.05%；
Ⅳ类水质样本数为12个，占总数量的28.57%；
Ⅴ类水质样本数为4个，占总数量的9.52%。优于地下水质量标准的Ⅲ类标准比例约为62%，其余水质均较差。由此可知，榆林市矿区周边地下水水质受到一定的污染。由各因子的权重W可知，主要的污染因子为NO-3，其次为SO2-4、NO-2，总硬度和TDS受污染较小。
2.2 CS-βGP-rhAm凝固时间、溶胀和pH值测试
凝固实验显示，6%、8%、10%βGP的CS凝胶凝固时间分别是5 min、6 min、6 min，并且测试6%βGP-CS凝胶的相变动力学曲线，6%βGP-CS 和6%βGP-CSrhAm分别从5、6 min起A值开始趋向稳定（图2AB）。6%βGP-CS相比8%和10%βGP-CS具有较高的溶胀率（＜0.01，图2C）。CS 溶于酸性溶液的pH 值为5.45±0.04，当CS结合4%、6%、8%、10%βGP的时候可以将水凝胶的pH分别提高为6.73±0.02、6.96±0.02、7.15±0.02、7.16±0.00，并且结合rhAm后和凝固后的pH值无明显变化（图2D）。
2.3 CS-βGP-rhAm体外降解和缓释rhAm性能的检测
观察金黄色葡萄球菌菌落的数量，相比对照组，CS-βGP能抑制金黄色葡萄球菌的生长，PGA则对于金黄色葡萄球菌的抑制效果不及CS-βGP（＜0.001），当CS-βGP负载rhAm后并不影响自身的抗菌特性，PGA负载rhAm后对抑制金黄色葡萄球菌的生长没明显变化（图4）。
2.4 抗菌效果检测
本实验通过测试3种不同浓度的βGP-CS凝胶在7 d内缓释rhAm的比例，7 d结果显示（6%、8%、10%）βGP-CS-rhAm凝胶药物缓释比例分别约达到58.4%、63.9%、70.0%。同时检测6%βGP-CS-rhAm在15 d内药物缓释的情况，结果显示15 d内凝胶缓释药物的比例约达到70.9%（图3A、B）。模拟口腔环境测试（6%、8%、10%）βGP-CS-rhAm 3周内的降解情况，结果显示随着时间的增加，凝胶的降解率越高，6%βGP-CS-rhAm凝胶保留率最高约达到20.1%，其余为10.4%和7.3%（图3C）。
2.5 细胞增殖、迁移实验
CCK8法结果显示，第1天与对照组相比，CS-βGPrhAm、PGA-rhAm、rhAm 的A 值均有增加（＜0.01），PGA-rhAm相比CS-βGP-rhAm的A值更高（＜0.01）。第2天，CS-βGP（＜0.01）和CS-βGP-rhAm（＜0.001）相比对照组A值高，CS-βGP 负载rhAm后相比rhAm组的A 值高（＜0.01），CS-βGP-rhAm 的A 值高于PGArhAm（＜0.001）。第3天与第2天的趋势一致，CS-βGP相比对照组A值提高更加显著（＜0.001，图5A）。蛋白水平上，CS-βGP-rhAm组相比对照组（＜0.001）、PGArhAm（＜0.01）组高表达Ki67，同时CS-βGP-rhAm 组（＜0.05）和CS-βGP 组（＜0.05）低表达CyclinD1（图5B）。划痕实验显示，CS-βGP、rhAm 和PGA组48 h内没有明显的促迁移作用，CS-βGP-rhAm和PGA-rhAm组相比于对照组能促进hPDLFs迁移（＜0.01），CS-βGP负载rhAm后相比rhAm组能够促进细胞在划痕中的迁移（＜0.05），但是rhAm与PGA结合后没明显的增益效果，CS-βGP-rhAm组相比PGA-rhAm组的差异没有统计学意义（图5C）。
2.6 细胞成骨分化实验
不同条件对hPDLFs 处理7 d 后，与对照组相比，CS-βGP 负载rhAm 上调collagen I（＜0.01）、RUNX2（＜0.001）、β-catenin（＜0.05）蛋白表达，PGA 负载rhAm对相关蛋白表达的影响不显著。RT-qPCR检测各实验组对RUNX2、OCN 基因表达水平的影响，RUNX2基因表达结果显示，和对照组相比，各实验组均能上调RUNX2基因的表达（＜0.05）。相比CS-βGP单独组，负载rhAm后能上调RUNX2基因的表达（＜0.01），并且CS-βGP-rhAm 组比PGA-rhAm 组更能上调RUNX2表达（＜0.05）。OCN基因表达结果显示，与对照组相比，各实验组均能提高OCN 基因的表达（＜0.05）。相比CS-βGP单独组，负载rhAm后能上调OCN基因的表达（＜0.05），并且CS-βGP-rhAm 组比PGArhAm组更能上调OCN表达（＜0.05，图6A、B）。利用碱性磷酸酶试剂盒对各实验组hPDLFs进行染色，4 d和7 d的染色结果显示，rhAm和CS-βGP组染色数量相比对照组多，PGA组无明显变化，CS-βGP负载rhAm后细胞染色强度和数量均高于对照组和PGA-rhAm组（图6C）。
临床治疗中通过注射Emdogain在牙周缺损部位并配合常规缝合手术使药物发挥长期的疗效。Emdogain在使用的过程中由于其载体PGA在37 ℃下仍然维持流动相，给手术的缝合带来不便。已有研究报道一种以乙二醇甲壳素为基础的热响应水凝胶支架，它能在30 s内由流动相转为非流动相，但短时间内的成型可能不便于手术缝合。本研究制备的CS-βGP-rhAm在37 ℃下5～6 min成型，推测能在口腔温度影响下对翻瓣手术后形成的缺口而成型，从而提高手术的效率。同时CS-βGP相比PGA具有一定的机械强度，具有机械强度的植入体一般有利于相关细胞附着从而有利于成骨分化。传统的PGA载体负载药物有增稠的效果，但是药物缓释情况并不稳定。关于药物在载体的缓释时间，有研究表明进行牙周手术后，上皮细胞在第2周内表现出较强的增殖能力，递送载体的缓释能力适合维持在2周以上，CS-βGP负载rhAm后具有至少15 d缓释和21 d的降解能力。有研究也利用温敏性壳聚糖凝胶作为载体负载胰岛素，48 h缓释率已经达到50%。而本研究的CS-βGP在48 h缓释率达到40%，这种差异可能与释放因子的相对分子质量有关，胰岛素的相对分子质量约为6000，而rhAm相对分子质量约为25 000。
由图4可知，料液比改变时，藕片硬度以及感官评分基本不变，综上可以推断得出料液比不是影响硬度的主要因素，因此在后续实验中不作为变量考虑。
符合临近水源，遗址点分布较为密集且出土实物文本较多较全，代表性较强，可以作为昂昂溪文化突出代表的是五福及滕家岗等处遗址。
患者在使用Emdogain治疗后需要定期使用抗生素，目的是为了预防伤口发生感染，这些很大程度与微生物定植相关。尽管PGA对牙龈卟啉单胞菌有显著的抑制作用，但对非致病性革兰氏阳性菌没有显着抑制作用。同时研究表明金黄色葡萄球菌是种植体周围感染的主要需氧菌，一旦微生物形成生物膜将大大降低临床的治疗效果。壳聚糖已被证实对牙龈卟啉菌的生长有抑制作用，本研究也证明CS-βGP相比PGA更能够抑制金黄色葡萄球菌生长。
修复牙周组织是牙周缺损治疗的目标，hPDLFs的增殖、迁移和成骨分化能力对于加速受损组织的恢复非常重要。CS-βGP促进hPDLFs增殖和迁移，rhAm和CS-βGP联用有明显的增益效果，PGA负载rhAm对细胞的增益效果没有前者明显。有研究表明羟基磷灰石与CS 混合可得到介孔结构支架，发现这种支架对hPDLFs没有毒性，但并没有促进细胞增殖的效果。ALP是成骨样细胞的标注物，相比PGA，CS-βGP可以诱导细胞表达ALP，同时CS-βGP负载rhAm后也明显上调相关成骨蛋白的表达。
综上所述，本研究对CS-βGP和PGA在表征、抗菌效果和生物相容性三方面进行效果评价，实验表明CSβGP具有替代传统PGA载体的潜力。
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