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茶凤官，刘 颖，高 峻, ，孔 胜，赵一明，周泳臣，左登鸿，吕才有，丁海琴，郑文忠,3
（1.云南农业大学茶学院，云南昆明 650100；
2.云南省现代农业茶叶产业体系建设栽培研究室，云南昆明 650201；
3.云南省普洱茶树良种场，云南普洱 665000）
茶树是我国重要的经济作物，茶树的嫁接始于20世纪70年代。目前茶树嫁接广泛应用于老茶园及低产茶园的换种改造、野生茶树的扩种和繁殖以及良种的保存等生产实践中；
同时随着良种优势在茶叶生产中逐步得到体现与发挥，低产、低效的老茶园改造已然成为当前茶产业发展中一个重要研究课题。而嫁接后的茶树因结合了接穗和砧木各自的优势，往往具有一种或多种显著的增益效果；
与此同时，嫁接后的茶树利用原有的强大根系吸收水分和矿质营养来满足接穗新梢发育的需要，所以可以比常规改植换种的茶树提早2～3年投产，减少老茶园改植换种的投入成本，是老茶园改造、更换新品种等行之有效的方法之一。在生产上，选择合适的砧木嫁接不仅可以增强对生物或非生物胁迫的抗性，还有助于提高产量、改良品质。
目前嫁接茶树的相关研究表明，茶树嫁接会使鲜叶中部分化合物含量发生改变；
吴姗等通过HPLS对嫁接茶树氨基酸含量变化进行分析，结果表明，两组供试茶样中都检出17种游离氨基酸，其中嫁接茶树中茶氨酸含量都高于对应的接穗品种；
另外梁月荣等对嫁接茶树及相应的接穗品种新梢的茶多酚、氨基酸、咖啡碱和儿茶素等生化成含量进行比较分析，结果表明，嫁接茶树的氨基酸和咖啡碱含量高于相应的接穗品种，而茶多酚和主要儿茶素类含量低于相应的接穗品种。另外，随着检测技术的进步，代谢组学技术已经被广泛运用于茶叶研究。例如，马成英等利用UHPLC-QTOF/MS平台结合代谢组学技术研究嫁接对茶叶次生代谢产物的影响，结果表明，不同砧木嫁接会对茶树鲜叶的次生代谢产物产生明显的影响；
邓威威等对茶/油茶嫁接体的次级代谢物含量进行分析发现，嫁接体叶片中的氨基酸、嘌呤碱和多酚含量比油茶叶片高，其中茶氨酸含量比油茶显著提高，咖啡碱含量比茶树叶片显著降低，嫁接体叶片中含有酚酸，而在油茶中未被检出。
近年来对茶树嫁接的研究大多都集中在嫁接技术、生物学特性、产量与抗逆性以及品种选育等方面，对于茶树嫁接后代谢物的变化研究却很少，且缺乏系统性的研究和分析；
所以本文以品种桃形叶为接穗、短接白毫为砧木进行茶树嫁接，并利用广泛靶向代谢物学技术分析嫁接前后茶树代谢物的变化。这在一定程度能够为嫁接后茶树鲜叶的加工和生产提供理论参考。
1.1 材料与仪器
实验茶样来源于云南省普洱良种场茶园，以品种桃形叶为接穗，短接白毫为砧木，采用切接法对茶树行嫁接；
待嫁接成活、生长旺盛后分别采摘其嫩芽（一芽一叶）立即放入液氮中冷冻保存，且每组进行3次生物学重复，具体的样品名称和编号如表1所示。甲醇、乙腈 色谱级，Merck公司；
标准品 纯度≥95%，Bio BioPha公司。
表1 样品信息及编号Table 1 Sample information and number
Scientz-100F冷冻干燥机 宁波新芝；
5424R离心机 艾本德中国有限公司；
MM400研磨机 德国RETSCH公司；
UPLC SHIMADZU Nexera X2超高液相色谱仪 日本岛津公司；
Applied Biosystems 4500 Q TRAP质谱仪 AB SCIEX公司；
Direct-Q3纯水仪 美国默克密理博公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品提取 将采摘回来的茶叶嫩芽放入冻干机中进行真空冷冻干燥，并将干燥后的茶样用研磨机研磨至粉状，取100 mg碾磨后的组织样溶解于1.2 mL 70%的甲醇提取液中，将溶液涡旋振荡后置于4 ℃冰箱过夜，12000 r/min离心10 min后，吸取上清，用0.22 μm微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。
质控样本（QC）由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性，在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。
1.2.2 色谱条件 色谱柱：AgilentSB-C（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；
柱温 40 ℃；
流速：0.35 mL/min；
进样量4 μL；
流动相A：0.1%的甲酸，流动相B：乙腈，洗脱梯度如表2所示。
表2 色谱阶梯洗脱条件Table 2 Chromatographic step elution conditions
1.2.3 质谱条件 ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；
源温度550 ℃；
离子喷雾电压5.5 kV；
帘气流速 25 psi；
GSI气体流速 50 psi；
GSII气体流速 60 psi；
碰撞诱导电离参数设置为高；
QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体设置为中等。
1.3 数据处理
基于自建数据库MWDB和二级谱信息进行物质定性；
通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度（CPS），用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，根据代谢物保留时间与峰型的信息对色谱峰的进行积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积（Area）代表对应物质的相对含量，然后导出所有色谱峰面积积分数据保存并利用（Unit Variance Scaling）进行数据的归一化处理，最后得到数据的定性和定量结果。利用Office 2010和Origin 2019进行数据的基本处理和相关图表的绘制；
通过R软件中的MetaboAnalystR包进行多元统计分析。
2.1 样本质控（QC）分析
通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流（TIC）图进行重叠分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，能为数据的重复性和可靠性提供重要的保障。QC质控样本的总离子流图如下图1所示，代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明样品离散少，仪器稳定，检测结果可靠。
图1 QC样本质谱检测TIC重叠图Fig.1 TIC overlap diagram of QC sample mass spectrometry detection
2.2 主成分分析
PCA 分析（Principal Component Analysis），即主成分分析，PCA分析本质上是一种无监督的多元统计分析方法，能从总体上反应各组样本之间的总体差异和组内样本之间的变异度大小；
PCA结果如图2所示，第一主成分（PC1）的贡献率为63.28%，第二主成分（PC2）的贡献率为10.56%，A1和B1两组样品表现出明显的分离趋势，说明嫁接前后的茶树代谢物具有较大差异。
图2 样品质谱数据PCA得分图Fig.2 PCA score of sample mass spectrometry data
2.3 代谢物差异分析
嫁接前后茶样中共检测到804种代谢物（包括正离子和负离子两种模式）；
为了进一步分析茶树嫁接前后代谢物的变化情况，利用偏最小二乘法判别（OPLS-DA）进行多元统计分析，同时基于OPLSDA模型中的变量重要性投影（VIP）值和差异倍数（FC）值进行差异代谢物的筛选；
当代谢物同时满足VIP≥1和FC值≥2或≤0.5这两个条件时，则认为该代谢物具有显著的差异性；
如下图3所示，两组样品中共筛选出10类105种具有显著差异的代谢物；
与嫁接前相比，嫁接后的茶样中有44种差异代谢物显著上调，61种差异代谢物显著下调，差异代谢物下调的数目大于上调，在这些差异代谢物中占比较多的是黄酮、脂质、酚酸、其他和核苷酸及其衍生物这5种类别，分别占差异代谢物总数的31%、15%、9%、9%和8%。在105种具有显著差异的代谢中有15种脂质、9种黄酮、9种核苷酸及其衍生物、6种鞣质、4种酚酸、4种生物碱、3种有机酸、2种氨基酸及其衍生物和10种其他物质在嫁接前的茶样中相对含量更高；
而有25种黄酮、6种酚酸、5种氨基酸及其衍生物、4种有机酸、1种脂质、1种鞣脂、1种生物碱、1种木脂素和香豆素物质在嫁接后的茶样中相对含量更高。
图3 A1 vs B1差异代谢物分类图Fig.3 A1 vs B1 differential metabolite classification map
为了更加直观地比较茶树在嫁接前后差异代谢物相对含量的变化情况，利用R软件包绘制了如图4所示的差异代谢物分类热图；
结果表明，与嫁接前相比，嫁接后的茶树大部分的黄酮类物质的相对含量显著增加，而脂质类、核苷酸及其衍生物和以糖醇类为主的其他类物质的相对含量则显著减少。
图4 差异代谢物分类热图Fig.4 Heat map of differential metabolite classification
为了更清楚地了解茶树在嫁接前后代谢物差异倍数的变化情况，制作了如图5所示的代谢物差异倍数柱状图，并将上调和下调的差异代谢物中排名靠前的20位代谢物进行展示。嫁接后茶树中有7种黄酮（山奈酚-3-O-桑布双糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷（烟花苷）、木犀草素-7-O-（2""-O-鼠李糖基）芸香糖苷、葫芦巴碱、木犀草素-6-C-葡萄糖苷-7-O-（6""-对香豆酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-刺槐糖苷-7-O-鼠李糖苷（刺槐苷）、5,7,4"-三羟基异黄酮-7-O-半乳糖苷-鼠李糖、金圣草黄素-8-C-葡萄糖苷（金雀花素）），2 种氨基酸（N--乙酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-亮氨酸）的相对含量要明显高于嫁接前；
而有3种其它类物质（D-果糖-1,6-二磷酸、吡哆素、1-（甘油-3-磷酸）-1D-肌醇）、2 种有机酸（2-羟基异己酸、DL-甘油醛-3-磷酸），2种酚酸（紫丁香苷、3,4"-二羟基-3"-甲氧基苯戊酸），1 种黄酮（山奈酚-3-O-（2-O-木糖基-6-O-鼠李糖基）葡萄糖苷），1 种鞣脂（2,3-二-O-没食子酰-D-葡萄糖）和1种核苷酸及其衍生物（2-脱氧核糖-5"-磷酸）的相对含量则明显低于嫁接前。说明嫁接后代谢物中相对含量较高的是黄酮和氨基酸，而嫁接前相对含量较高的是有机酸和酚酸。
图5 代谢物差异倍数柱状图Fig.5 Histogram of metabolite difference multiple
2.4 差异代谢物通路分析
利用KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析，结果表明，共有38条通路，且差异代谢物主要分布在嘌呤代谢、烟酸酯和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、光合生物的固碳作用、咖啡碱代谢、次级代谢产物的生物合成等20条代谢途径中，如图6所示。另外，在筛选出的105种具有显著差异的代谢物中被KEGG注释到的有24种，主要包括7种核苷酸及其衍生物、6种黄酮、3种其他、2种氨基酸及其衍生物、2种生物碱、2种有机酸、1种酚酸和1种脂质；
差异代谢物被注释最多的是黄酮和核苷酸及其衍生物这2种类别；
其中核苷酸及其衍生物类主要参与嘌呤代谢、次级代谢产物的生物合成和咖啡因代谢等多条代谢通路，且被KEGG注释到的尿苷5"-二磷酸、7-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、鸟嘌呤、黄苷、2"-脱氧肌苷-5"-单磷酸和2-脱氧核糖-5"-磷酸这7种核苷酸及其衍生物均全部显著下调；
而黄酮类物质主要参与类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、次级代谢产物的生物合成等多条代谢通路，且被KEGG注释的6种黄酮中山奈酚-3-O-芸香糖苷（烟花苷）、山奈酚-3-O-鼠李糖苷（阿福豆苷）（番泻叶山奈苷）、矢车菊素-3-O-（6""-O-对香豆酰）葡萄糖苷、根皮素和芹菜素这5种代谢物则显著上调，而柚皮素-7-O-葡萄糖苷（樱桃苷）则显著下调。
图6 嫁接前后差异代谢物KEGG富集图Fig.6 KEGG enrichment diagram of differential metabolite before and after grafting
嫁接是茶树良种繁育最直接有效的方法之一，通过嫁接可以最大程度地保留接穗品种的优良特性，而茶树作为一种重要的经济作物，其主要的价值就在茶树的鲜叶上。鲜叶质量是导致茶叶品质形成的重要因素之一，而鲜叶质量在很大程度是由里面的内含物质含量所决定的，所以研究茶树嫁接前后代谢物含量的变化，能够为嫁接茶树的茶叶加工提供一定的理论参考。
通过前文的研究发现，茶树嫁接前后代谢物具有明显的差异性，分析代谢物的差异倍数可知，导致差异的主要原因可能是嫁接后茶树中氨基酸和黄酮类物质大量积累，以及酚酸和有机酸等物质的消耗。另外，通过对KEGG代谢通路的分析，发现黄酮类物质显著上调，而核苷酸及其衍生物则显著下调；
这可能与嫁接后茶树中相关代谢通路中酶的活性或者基因的表达有关，但目前针对茶树嫁接后代谢物的变化的研究较少，因此，嫁接茶树代谢物的具体变化机理还需做进一步探索。除此之外，吴珊等研究也发现嫁接后茶树体内游离氨基酸含量有所增加，同样王文建将铁观音嫁接到6个不同品种砧木上，结果表明嫁接后的茶树中氨基酸、茶多酚和水浸出物等含量增加，这与本文的研究结果大体一致。所以在接下来的研究中可以通过代谢组和转录组联合分析的方法，对相关通路中的差异代谢物进行进一步的研究和分析。
利用广靶代谢组学技术对茶树（桃形叶）嫁接前后的代谢物进行检测，两组茶样PCA表现出明显的分离趋势，说明茶树嫁接前后代谢物具有较大的差异。另外，嫁接前后的茶样中共筛选出10类105种具有显著差异的代谢物，这些差异代谢物中的大部分黄酮类和氨基酸及其衍生物相对含量明显增加，而脂质类、核苷酸及其衍生物、酚酸类等物质的相对含量则明显减少，同时，分析代谢物的差异倍数，发现在嫁接后的茶树中相对含量较高的代谢物是黄酮和氨基酸，而嫁接前相对含量较高的代谢物是酚酸和有机酸，这些滋味物质含量的变化会对茶树鲜叶品质造成影响。此外，通过KEGG代谢通路的分析，发现代谢物在38条代谢通路中富集，且大部分的差异代谢物分布在嘌呤代谢、类黄酮生物合成、次级代谢产物的生物合成等20条代谢途径中；
与此同时，被KEGG注释到的大部分黄酮类物质显著上调，而核苷酸及其衍生物则显著下调。综上所述，品种桃形叶通过嫁接会使代谢物的含量发生明显的改变，这在一定程度上能够为嫁接茶树的茶叶加工、生产等提供参考。
