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李晓娇，段绍丽，曹凯红，宋志姣
(保山学院资源环境学院，云南 保山 678000)
1.1 材料与仪器
铁皮石斛(云南省保山市龙陵县林源石斛开发有限公司)；
无水乙醇、盐酸、硝酸(四川西陇化工有限公司)；
亚硒酸钠 (山东西亚化学工业有限公司)；
没食子酸、硫酸亚铁、抗坏血酸(国药集团化学试剂有限公司)；
冰乙酸、水杨酸(天津市风船化学试剂科技有限公司)；
过氧化氢(重庆东方试剂厂)；
透析袋(MD44-5M 截分子量：8000-14000，美国联合碳化)；
以上所用试剂均为分析纯。
真空干燥箱 (DZF-6020上海-恒科学仪器厂)；
微波炉(G80F23CN3L-C2广东格兰仕微波生活电器制造有限公司)；
微波消解仪(MARS6美国CEM)；
电感耦合等离子体发射光谱仪(ICAP7400赛默飞世尔)；
傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iS5赛默飞世尔)。
1.2 试验方法
1.2.1 材料预处理 铁皮石斛鲜条于恒温干燥箱中60 ℃烘干48 h，粉碎过80目筛，于密封袋密封，置于干燥器中保存，备用。
1.2.2 铁皮石斛多糖的提取 准确称取1.2.1获得的铁皮石斛粉末5.00 g于500 mL烧杯中，加入300 mL纯水，混匀后，置于微波炉内间歇加热2 min(350 W，每次加热30 s)，然后于60 ℃水浴60 min，提取液趁热离心过滤(3000 r/m，30 min)，取上层清液，于旋转蒸发仪(60 ℃)中浓缩至原体积的1/3，冷却至室温。再加入5倍体积的无水乙醇沉析，抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤3次后60 ℃真空干燥24 h，得铁皮石斛多糖提取物，命名为DCP。
1.2.3 铁皮石斛多糖的硒化 准确称取0.20 g DCP溶于10 mL水中，加入0.30 g亚硒酸钠，加入0.30 mL冰乙酸，搅拌均匀，于60 ℃水浴中反应24 h。反应结束后离心过滤(4000 r/min，30 min)，转移上清液于透析袋中，纯水流动透析8 h，透析至加入抗坏血酸5 min透析液不呈现红色为止[14]。透析结束后将未透过液(透析袋内)减压浓缩至原体积的1/2，然后加入5倍体积无水乙醇于2 ℃下醇析12 h[12-16,17]，真空干燥箱60 ℃干燥24 h得硒化铁皮石斛多糖，命名为Se-DCP。
1.2.4 Se-DCP的硝化 称取1.2.3制备的Se-DCP 10.00 mg，于消解罐中，再加入5.0 mL浓硝酸，100 ℃下预消解70 min。取出预消解液在通风橱中补加入浓盐酸15.0 mL，继续微波消解100 min：微波消解仪设置消解时间为第一步15 min升温至130 ℃，保持10 min；
第二步15 min升温至150 ℃，保持时间为10 min，第三步15 min升温至180 ℃，保持10 min，冷却25 min后取出冷却至室温。此时溶液澄清，无沉淀，消解完全。将消解液过滤于50 mL容量瓶中，用少量纯水洗涤消解罐3～4次，洗涤液全部转移入容量瓶中，纯水定容至刻度线，振荡摇匀，静置即为待测样溶液。
1.2.5 ICP-AES 测定硒的含量 参照程庆龙等[18]的方法稍作修改，ICP-AES测定条件为：RF功率为1150 W，泵速50 r/min，辅助气流量0.5 L/min，雾化器气体流量0.5 L/min，样品冲洗时间20 s，短波范围7 s。
1.2.6 硒标准曲线的绘制 分别移取0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL 100 μg/mL的硒标准溶液于100 mL容量瓶中，用0.02%的稀硝酸稀释至刻度，摇匀。根据1.2.5的试验条件，用ICP-AES于196.026 nm下测得其标准曲线方程为Y=29.353X+0.9818，r=0.999 98，如图1所示。
1.2.7 单因素试验 按照1.2.3的方法，准确称取DCP 0.20 g于5只50 mL锥形瓶中，加入10 mL纯水溶解。固定亚硒酸钠用量1.0∶1.5[m(DCP)∶m(亚硒酸钠)]，硒化温度60 ℃，硒化时间为24 h，冰乙酸用量0.3 mL，分别考察亚硒酸钠用量：1.0∶0.5、1.0∶1.0、1∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5 [m(DCP)∶m(亚硒酸钠)]，硒化时间6、12、24、36、48 h，硒化温度：40、50、60、70、80 ℃，冰乙酸用量：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL对多糖硒化的影响，按1.2.3方法对反应物进行后处理。每组试验重复3次。
1.2.8 正交试验 以单因素试验结果为基础，进行铁皮石斛多糖硒化工艺的正交优化试验。以亚硒酸钠用量(A)、硒化时间(B)、硒化温度(C)进行L9(34)的正交试验，试验因素及水平见表1。
1.2.9 Se-DCP对·DPPH的清除能力测定 参考罗敏[15]等的方法，分别取2 mL浓度为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg/mL Se-DCP样品溶液(纯水配制)于6支比色管中，分别加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(95%乙醇配制)，振荡混匀后避光25 ℃下暗反应30 min，反应结束后在517 nm波长下测定吸光度，抗坏血酸(Vc)作为阳性对照组，纯水为空白对照组，平行3次，按照(1)式计算清除率：
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清除率(%) =[(A0-A1+A2)/A0]×100
(1)
式中，A0：2 mL纯水+2 mL DPPH溶液的吸光度；
A1：2 mL Se-DCP (或Vc)+2 mL DPPH溶液的吸光度；
A2：2 mL Se-DCP (或Vc)+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度。
图1 硒标准曲线Fig.1 Standard curve of selenium
1.2.10 Se-DCP对·OH的清除能力测定 根据文献方法[15,19-21]，分别取2 mL 浓度为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg/mL Se-DCP样品溶液(纯水配制)于6支比色管中，然后先加入2 mL 10 mmol/L 的FeSO4溶液，再加入8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL，充分混匀后加入2 mL新配制的9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，在35 ℃下水浴加热30 min后于510 nm波长处测其吸光度值。Vc作为阳性对照组，纯水为空白对照组，平行3次，按照(1)式计算对·OH的清除率。其中，A0：空白组吸光度，A1：样品组、阳性对照组的吸光度，A2：2.0 mL 95%乙醇溶液代替9 mmol/L 水杨酸乙醇溶液的吸光度。
表1 正交试验因素水平
按照(1)式计算清除率。
其中，A0：空白对照吸光度值；
A1：样品组、阳性对照组的吸光度；
A2：同体积的纯水代替邻苯三酚的吸光度。
1.3 数据处理
采用SSPS 22.0软件对单因素水平进行多重比较、正交试验设计和正交结果方差分析；
采用Origin 2019软件进行绘图。
2.1 Se-DCP的红外光谱分析
由图2可知，硒化前后，DCP和Se-DCP的FTIR光谱图有所变化，但变化不大，表明铁皮石斛多糖在硒化前后结构上没有较大的改变。其中Se-DCP的FTIR光谱图中，3332.31 cm-1为—OH的伸缩振动峰，2920.76 cm-1为糖类CH3、CH2、CH等C—H的伸缩振动峰，1731.79和1639.6 cm-1为C=O的伸缩振动峰，1373.39和1224.74 cm-1为C—H的变角振动峰，1022.05 cm-1处是糖残基C—O—C和C—O—H键的伸缩振动峰，在831.87 cm-1为吡喃葡萄糖的特征吸收峰[13]，在756.55 cm-1处，Se-DCP比DCP多出的峰为亚硒酸酯的特征吸收峰，因此可判断：DCP分子上发生了硒化反应，且硒以亚硒酸酯的形式存在[24]。
图2 DCP和Se-DCP的FTIR光谱图Fig.2 FTIR spectrogram of DCP and Se-DCP
2.2 单因素试验结果
2.2.1 亚硒酸钠用量对硒含量的影响 由图3可知，当DCP与亚硒酸钠质量比低于1∶1时，随着亚硒酸钠用量的增加Se-DCP中硒含量呈现上升趋势，用量比为1∶1时，硒含量达到最大为0.75 mg/g；
当亚硒酸钠用量大于1∶1时，随着亚硒酸钠用量的增加，硒含量呈下降趋势，且DCP与亚硒酸钠质量比为1.0∶1.5和1.0∶2.0时，硒含量无显著差异(P>0.05)，可能的原因是，如果溶液中SeO32-离子浓度太大，会影响Se-DCP的存在状态，使部分产物解离，从而影响产物硒含量[25]。
图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同The different lowercase letters in the figure indicate a significant difference (P<0.05), the same as below图3 亚硒酸钠用量对硒含量的影响Fig.3 Effect of sodium selenite on selenium content
2.2.2 硒化时间对硒含量的影响 如图4所示，随着硒化时间的增加，反应制得的Se-DCP中的硒含量差异显著(P<0.05)，并呈现先增加后减少的趋势。在反应时间为12 h时，Se-DCP中的硒含量最高，为0.75 mg/g。硒化时间为6～12 h时，硒含量随着反应时间的增加而急剧增加，硒化时间大于12 h时，硒含量随着硒化时间的增加而逐渐减小。原因是，硒化时间短，DCP与亚硒酸钠反应不充分，导致硒与DCP不能有效结合；
但是当硒化时间过长时，DCP在高温和酸性条件下发生降解，影响硒化反应进行。
图4 硒化时间对硒含量的影响Fig.4 Effect of the selenization time on the selenium content
2.2.3 硒化温度对硒含量的影响 如图5所示，当反应温度在40～60 ℃时，硒含量随温度升高而缓慢增加；
当温度在60～70 ℃时，硒含量随着温度的上升急剧增大；
当温度为80 ℃时，硒含量与70 ℃时无显著差异(P>0.05)，说明DCP的硒化基本达到饱和，但是由于多糖在高温度条件下易分解，因此硒化温度不宜过高，故选择60、70、80 ℃进行正交试验。
图5 硒化温度对硒含量的影响Fig.5 Effect of selenization temperature on selenium content
2.2.4 冰乙酸用量对硒含量的影响 如图6所示，随着冰乙酸用量的增大，硒含量逐渐增大。在冰乙酸用量大于0.6 mL之后，随着冰乙酸用量的增加，Se-DCP中的硒含量无显著差异(P>0.05)。冰乙酸在反应中作为催化剂，适宜的量有助于反应的进行，可以使硒化反应进行得更彻底，促进硒与多糖结合，当催化剂过量时可能会对反应带来其它的影响，因此选择最佳的催化剂用量为0.6 mL。
图6 冰乙酸用量对硒含量的影响Fig.6 Effect of iced acetic acid dosage on selenium content
2.3 正交试验
从表2直观分析和极差分析结果来看，最佳工艺条件均为A1B3C3，从方差分析表(表3)中F值可知，在制备过程中3个因素对硒含量的影响的大小顺序为C>B>A，且因素C(反应温度)对硒化反应的影响极显著(P<0.01)。从正交试验表来看，RC>RB>RA，3个因素对硒含量的影响大小与方差分析结果一致。因此，DCP的最佳硒化条件为：A1B3C3，即DCP与亚硒酸钠比例为1.0∶0.5，硒化时间24 h，硒化温度80 ℃，冰乙酸用量为0.6 mL，在此工艺下重复试验8次，得硒的平均含量为2.35 mg/g。
表2 正交试验结果
表3 正交试验方差分析
2.4 硒化铁皮石斛多糖的抗氧化活性
2.4.1 Se-DCP对·DPPH的清除能力 如图7所示，当Se-DCP的浓度低于1.8 mg/mL时，随着Se-DCP浓度的增加，对·DPPH的清除率逐渐增加，当Se-DCP的浓度大于1.8 mg/mL 时，对·DPPH的清除能力基本达到饱和，为93%左右；
Se-DCP的浓度低于1.4 mg/mL 时，Se-DCP对·DPPH的清除能力小于Vc，但当浓度大于1.4 mg/mL 时，其清除能力显著高于Vc(P<0.05)，可见，在高浓度时，Se-DCP对·DPPH的清除能力优于Vc。
图7 Se-DCP对·DPPH的清除率Fig.7 Se-DCP removal rate of ·DPPH
2.4.2 Se-DCP对·OH的清除能力 如图8所示，Se-DCP对·OH的清除能力与Se-DCP的浓度存在明显的量效关系。当浓度小于1.8 mg/mL时，Se-DCP对·OH的清除率明显小于Vc，相同浓度Vc溶液对·OH清除效果均能达到80%以上；
当浓度大于1.8 mg/mL时，Se-DCP对·OH的清除率与Vc无显著差异(P>0.05)，均大于85%。由此可知，在高浓度下，Se-DCP对·OH清除能力与Vc相当，当在低浓度时，Se-DCP对·OH的清除能力较差。
图8 Se-DCP对·OH的清除能力Fig.8 Se-DCP removal rate of ·OH
图9 Se-DCP对的清除能力Fig.9 Se-DCP removal rate of
3.1 硒化铁皮石斛多糖的制备工艺
本试验硒化铁皮石斛多糖采用冰乙酸做催化剂，可促进硒与多糖结合，当冰乙酸用量为0.6 mL[v(DCP)∶v(冰乙酸)=1∶3 g/mL]时，硒含量达到最大值，继续增加冰乙酸用量，硒含量增加不显著，但过量的冰乙酸会使多糖水解，因此最佳的催化剂用量为0.6 mL。在最佳硒化工艺下，硒化铁皮石斛多糖的硒含量为2.35 mg/g，与葛明明等[14]制备的硒化蒲公英多糖、侯巍等[13]制备的硒化玉米须多糖中硒含量相当。硒是人体生理必需的微量元素之一，缺硒是一些疾病的诱因，硒过量则会引发中毒，中国营养学会发布报告认为成人每天适宜的膳食硒摄入量应为50～250 μg。因此本试验制备的Se-DCP可作为有机硒食品原料。
3.2 硒化铁皮石斛多糖的抗氧化活性
