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周菲
（1黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，150086，黑龙江哈尔滨；
2黑龙江省农业科学院经济作物研究所，150086，黑龙江哈尔滨）
向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上重要的油料作物之一。植物油的脂肪酸组成决定了它们的品质和用途，从营养价值和工业应用的角度来看，有必要降低植物油中饱和脂肪酸含量。高油酸是一种单不饱和脂肪酸，由于含高油酸的食用油在烹饪、加工或储存时具有更高的抗氧化稳定性，因此，提高种子中油酸所占比例也是向日葵品质改良的重要目标。LACS编码长链酰基CoA合成酶，在高等植物中，LACS参与了多种代谢途径且被定位在多种细胞器中，例如内质网[1]、叶绿体[2]和过氧化物酶体[1]。LACS能把游离脂肪酸转化成长链酰基CoA，在脂肪酸合成、分解及其他相关代谢过程中发挥重要功能[3]。油菜BnLACS2基因的过表达导致转基因油菜中的油含量明显增加，而BnLACS2-RNAi转基因油菜的油含量降低[4]。在向日葵中，LACS1和LACS2蛋白分别在质体和内质网上表达，参与种子发育过程中油脂的合成[5]。
本研究通过分析实验室前期获得的高、低油酸向日葵种子的转录组测序数据，在脂肪酸生物合成代谢通路中鉴定出显著差异表达的HaLACS7基因，以此为基础，对该基因编码蛋白进行生物信息学分析，并对HaLACS7在高、低油酸向日葵不同发育时期的种子以及其他组织部位的表达模式进行分析，为后续该基因功能的进一步研究提供理论依据。
1.1 试验材料
于2019年将向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”和低油酸保持系“86-1”种植在黑龙江省农业科学院经济作物研究所试验基地（哈尔滨呼兰区康金镇）。从开花7d起，每5d取1次样，取至开花后37d，每次取花盘最外3圈的种子，同时取开花后7d的向日葵根、茎、叶、管状花和舌状花，将材料经液氮速冻后存于-80℃冰箱，用于实时荧光定量PCR分析。
1.2 试验方法
1.2.1 基因的生物信息学分析 在NCBI的BLAST数据库中进行序列同源性比对和相似性搜索。利用ExPASy系统下的蛋白质基本理化性质预测工具 Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）预测氨基酸组成、相对分子量、等电点和原子组成等参数。利用SOPMA在线程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.ht ml）分析蛋白的二级结构。利用ProtScale在线软件（http://web.expasy.org/protscale/）分析基因氨基酸序列的亲/疏水性。利用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在线软件预测基因的亚细胞定位。利用MEGA7.0软件构建系统进化树。
1.2.2 荧光定量PCR分析 利用植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]对向日葵种子总RNA进行提取，取0.5μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第1条链。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）试剂，Roche LightCycler 480II荧光定量PCR仪，以向日葵β-actin基因（AF282624）为内参基因，Real-Time PCR 总反应体系为 20μL（cDNA 1.2μL，SYBR Green 10μL，前、后引物各 0.6μL，ddH2O 7.6μL）。Real-Time PCR 反应程序如下：98℃ 2min；
98℃10s，58℃10s，68℃30s，共45个循环，待PCR反应结束后进行溶解曲线分析，采用2-ΔΔCt法分析HaLACS7基因的表达量。内参基因β-actin引物为 F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCA GCTTCCATTCCAATCA。HaLACS7基因荧光定量引物为F：TGCTTTGGTTGTCCTGT，R：CGAGG TGACATCGTTGA。
2.1 HaLACS7生物信息学分析
2.1.1 蛋白质基本理化性质预测HaLACS7基因包含948bp的开放阅读框，编码315个氨基酸。蛋白质基本理化性质预测表明，HaLACS7基因编码蛋白的原子总数为4990个，分子式为C1611H2477N421O464S17，蛋白分子量35.71kD，等电点理论值5.82，预测该蛋白是酸性蛋白，HaLACS7编码蛋白氨基酸组成见表1。
表1 向日葵HaLACS7编码蛋白质氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of protein encoded by HaLACS7 in sunflower
2.1.2 蛋白质二级结构预测 预测分析HaLACS7编码蛋白质的二级结构，结果显示该蛋白质具有24.76%的α-螺旋、45.08%的无规则卷曲、23.81%的延伸链和6.35%的β-转角。预测结果（图1）表明，HaFATB编码的蛋白质二级结构为无规则卷曲。
图1 向日葵HaLACS7编码蛋白质二级结构预测Fig.1 Secondary structure prediction of protein encoded by HaLACS7 in sunflower
2.1.3 蛋白质亲疏水性分析和亚细胞定位预测 由图2可知，大于0部分多于50%为疏水性蛋白，而小于0部分多于50%为亲水性蛋白，HaLACS7编码蛋白为亲水性蛋白。Cell-PLoc 2.0软件预测HaLACS7编码蛋白亚细胞定位于过氧化物酶体。
图2 向日葵HaLACS7编码蛋白质亲/疏水性分析Fig.2 Hydrophilic/hydrophobic analysis of protein encoded by HaLACS7 in sunflower
2.1.4 HaLACS7基因系统进化分析 将向日葵HaLACS7与大豆（Glycine max L.）、甘蓝型油菜（Brassica napus L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）等物种的LACS基因以及拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）LACS家族9个基因的氨基酸序列进行系统进化树的构建与分析（图3），发现向日葵HaLACS7与其他物种的LACS7和LACS6基因进化关系较近，且与同属菊科的莴苣（Lactuca sativa L.）和洋蓟（Cynara cardunculus var.scolymus L.）的LACS6进化关系最近，序列相似性均为84%，向日葵HaLACS7与拟南芥LACS6和LACS7聚在一个大分支上，而拟南芥LACS家族其他7个基因聚在另一个大分支上。
图3 向日葵HaLACS7基因系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HaLACS7 gene in sunflower
2.2 HaLACS7基因表达分析
由图4可知，HaLACS7在高、低油酸向日葵种子不同发育时期表达量变化趋势明显不同，在“86-1”种子花后27d表达量最高，其次是花后37d，在花后22d不表达，其他时期表达量较低。“L-1-OL-1”种子在花后37d表达量最高，其次是花后22和32d，在花后7d表达量较低，其他时期不表达（图4）。总体来说，HaLACS7在2份材料种子发育后期表达量均较高。HaLACS7在向日葵开花后7d时组织中的表达量排序为舌状花＞根＞种子＞管状花＞叶＞茎。
图4 HaLACS7基因在不同发育时期及不同部位表达模式Fig.4 The expression patterns of HaLACS7 gene at different development stages and different parts
拟南芥中发现的LACS基因家族共有9个成员，命名为AtLACS1-9[6]，其中AtLACS6和AtLACS7存在于过氧化物酶体中，能够参与拟南芥脂肪储备中脂肪酸的降解[7]，并与脂肪酸β-氧化途径有关[1]。本研究通过对向日葵HaLACS7与其他物种LACS基因系统进化的分析，发现向日葵HaLACS7与拟南芥AtLACS6和AtLACS7聚在一个大分支上，亚细胞定位预测HaLACS7编码蛋白定位于过氧化物酶体，这也与AtLACS6和AtLACS7亚细胞定位结果一致，这表明HaLACS7与拟南芥AtLACS6和AtLACS7功能上可能存在一定的相似之处，可能在脂肪酸β-氧化等代谢的过程中起关键作用，这些生理过程可为向日葵种子发育油脂积累提供必要的能量和碳源[8]，本研究可为向日葵HaLACS7基因功能的深入研究提供理论基础。
拟南芥LACS基因表达分析显示，除AtLACS5在花中特异表达之外，其他成员在各组织中普遍转录，但具有明显的器官或组织特异性，且大部分AtLACS基因在花以及萌发的种子中大量表达，表明这些基因不仅参与花组织的油脂代谢，而且对种子甘油酯的合成起到关键作用[9]。与拟南芥AtLACS7同源性较高的油茶CoLACS1基因在种子发育各时期平稳表达，表达丰度变化不大[10]。LACS6在花生子房柄和花的表达量极高，与根、茎、叶和仁等组织有极显著差异，其表达量为花＞子房柄＞叶＞仁＞茎＞根[11]。本研究中HaLACS7在向日葵舌状花中相对表达量非常高，这与花生LACS6和拟南芥LACS基因表达结果一致，在2份高、低油酸向日葵材料种子发育后期表达量均较高，可能主要在于弥补呼吸作用等引起的能量消耗以及维持种仁油脂含量动态平衡[12]。
目前，关于植物LACS基因影响脂肪酸组成研究的报道较少。在亚麻中通过体内、体外试验[13]发现，LuLACS8A和LuDGAT2-3共表达能催化亚麻酸（18:0）在三酰甘油中富集。分别与拟南芥LACS9和LACS8基因序列同源的向日葵HaLACS1和HaLACS2在发育中的种子中表达水平较高，2种酶表现出相似的底物特异性，均对油酸的选择性很高[5]。本研究中HaLACS7在低油酸材料种子发育前期，随着种子油脂积累，HaLACS7表达逐渐上调，在发育后期表达量较高；
而在高油酸材料中除了在种子发育中期和后期表达量较高，其他时期基本不表达，HaLACS7在高、低油酸向日葵种子不同发育阶段表达变化趋势明显不同，推测HaLACS7表达可能影响向日葵种子油酸的合成，由于植物油脂的合成涉及多层次的复杂网络调控，基因具体功能仍需后续进一步研究。
预测向日葵HaLACS7编码蛋白为酸性且为亲水性蛋白，蛋白二级结构为无规则卷曲，预测亚细胞定位于过氧化物酶体。系统进化分析发现，HaLACS7与莴苣和洋蓟的LACS6进化关系最近，序列相似性均为84%，且与拟南芥LACS6和LACS7聚在一个大分支上，表明它们功能可能相似。HaLACS7在向日葵组织中的表达量为舌状花＞根＞种子＞管状花＞叶＞茎，HaLACS7在高、低油酸向日葵种子发育后期表达量均较高，但在2份材料种子不同发育时期表达变化趋势明显不同，推测HaLACS7表达可能影响向日葵种子油酸的合成。
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