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孟素玲，田彦梅，顾 欣，孙小涵，王新谱
（宁夏大学农学院，银川 750021）
木霉Trichodermaspp.作为重要的生防真菌，其高效生防菌株的筛选及作用机制一直倍受关注。目前，常用的生防木霉有哈茨木霉T.harzianum、绿色木霉T.viride、棘孢木霉T.asperellum、钩状木霉T.hamatum、长枝木霉T.longibrachiatum和康氏木霉T.koningii等[1-6]。木霉具有多种生物防治机制，如竞争作用[7]、重寄生作用[8]、诱导抗性作用[9]和抗生作用[10]等。有的木霉在抑制病原菌的同时还能够促进植物生长，提高植株抗逆性[11]。因此，木霉菌不仅用于植物病害防控，还用于作物健康生态环境的构建与调节。然而，使用单一木霉菌防治农作物病害的效果有时不理想，因此木霉与其他生物或非生物因素在防病方面的协同作用越来越受到关注。协同防病作用（Synergistic disease prevention，SDP）是指生防菌基于自身生物防治机制，协同其他微生物、药剂、营养物质等共同防治病害，使多种机制同时或顺时发挥作用，从而达到增强防效的目的。本文对木霉菌SDP的研究进展进行了阐述，以期为今后木霉菌参与的病害防治研究提供参考。
营养匮乏和生存空间缺失是微生物最常见的死亡原因。木霉往往具有较强的营养物质吸收和空间占位能力，助力其对病原菌的防控和抑制[12]。其中，对有限营养物质的竞争成为生防木霉遏制植物致病菌的有效途径。如多数丝状真菌生存都需要的铁。在缺铁情况下，木霉菌产生高效的铁载体，竞争性地螯合环境中有限的铁，从而阻止病原真菌生长[13]。哈茨木霉可编码葡萄糖转运体，保证其在底物浓度非常低的环境中也能表达高水平的葡萄糖亲和力[14]，由此形成较高的营养竞争能力，对环境适应性更强。除营养竞争外，木霉还能快速占领生存空间来抑制病原菌。在木霉与大豆根腐病镰刀菌的对峙培养中，木霉的生长速度远快于镰刀菌，显著压缩和挤占了病原真菌的生存空间[15]。这种机制在土壤中也有体现。施用木霉菌剂的作物，其根际土壤中的细菌、放线菌和木霉菌数量显著增加，而其他病原真菌数量显著下降[16]。
木霉具有重寄生作用和降解病原菌细胞壁的能力。此过程包含一系列事件，涉及木霉对病原菌的侵染、识别、接触、缠绕、穿透和寄生等[17]。病原真菌细胞表面的凝集素是诱导木霉重寄生、合成并分泌细胞壁降解酶的信号分子[18]。木霉识别宿主菌后，启动一系列与重寄生相关的信号通路，如编码胞外蛋白酶、寡肽转运蛋白和G蛋白偶联受体的基因进行表达[19,20]。在抗菌过程中，木霉分泌的胞外蛋白酶以几丁质酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和蛋白酶等细胞壁降解酶为主[21]，促使病原真菌细胞壁快速水解，导致病原菌死亡[22]。转录组分析结果表明，立枯丝核菌Rhizoctoniasolani使绿色木霉部分基因上调表达，涉及7个识别和信号转导基因，6个几丁质酶基因，6个葡聚糖酶基因和 1个蛋白酶基因[23]。拟康宁木霉T.pseudokoningii菌丝可依附和缠绕花生核盘菌Sclerotiniasclerotiorum菌丝，继而侵入并寄生，最终导致病原菌菌丝体膨胀、裂解至消亡[24]。
抗生作用是木霉生物防治的重要机制之一。木霉可合成多种非挥发性和挥发性抗菌物质，以阻止病原菌的生长和定殖[25]。这些抗菌物质包括胶霉素、吡喃酮、萜类化合物和抗菌肽等。Wonglom 等[26]采用气相色谱-质谱联用技术分析了木霉 T76-12/2释放的挥发性有机物，发现其中含有苯乙醇和倍半萜烯等抗真菌化合物。绿色木霉产生的绿胶霉素能抑制灰霉病菌Botrytiscinerea孢子萌发[27]。哈茨木霉合成的哈茨酸对终极腐霉Pythiumultimum和灰霉病菌均有抗菌活性[28]。
除以上直接作用，木霉还能通过诱导植物系统抗性和局部抗性发挥间接防病作用。木霉定殖于植物根际或根内，产生刺激植株生长和诱导植物防御反应的化合物，使植株生理生化特征发生变化[29]。如深绿木霉T.atroviride和哈茨木霉产生的次生代谢产物6-戊基-α-吡喃酮，使油菜幼苗的病程相关蛋白（PR-蛋白）基因上调表达，诱导植株对油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeriamaculans和灰霉病菌产生系统防御反应[30]。许多木霉都能提高植株的防御酶活性，激发植物防御作用。如里氏木霉T.reesei、绿色木霉和深绿木霉通过分泌聚酮，触发植物体内苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）的表达，促进酚类物质合成，发挥防御作用[31]。棘孢木霉能显著提高辣椒叶片的过氧化物酶（Peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、PAL 活性和叶绿素含量[32]。绿色木霉能刺激黄瓜产生蛋白激酶，诱导黄瓜系统抗性，降低植株细菌性角斑病的发生率[33]。哈茨木霉能诱导黄瓜叶片 POD、PAL、PPO、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性增加，降低黄瓜灰霉病的发病指数[34]。
木霉的生防机制多样且复杂，其生防效果是多种机制共同作用的表现。因此，基于多机制的抗菌防病作用在木霉属中较为普遍。长枝木霉T6抑制美洲南瓜枯萎病菌Fusartumoxysporium的机制包括空间竞争、菌丝缠绕、抗菌物质抑制病菌孢子萌发等[35]。木霉主要利用重寄生作用和抗生素抑菌作用拮抗菜豆根腐病菌[36]。棘孢木霉GYSW-6m1对草莓炭疽菌的生防机制主要包括竞争作用、重寄生作用和通过产生非挥发性代谢产物来抑制病原菌[37]。
2.1 木霉与其他微生物的协同作用
互不拮抗的生防菌联合使用，可以显著提高微生物在共培养条件下及复杂环境中对植物病害的防治效果[38]。因此，应用相容和（或）亲和的多种微生物进行复配已成为生防治剂的研发趋势。此外，在复杂的农业系统中，木霉能够与细菌、真菌等多种微生物构成联盟直接或间接提高植物防控病害的能力。
2.1.1 木霉与细菌的协同作用 木霉和有益生防细菌共培养可激发单一培养时未被激活或表达水平较低的基因或代谢通路，刺激或增强次生代谢物的产生，从而提高植株的综合抗性[39,40]。深绿木霉SG3403和枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis的代谢物对禾谷镰孢菌F.graminearum的抑制率分别为0和46%，而二者共培养的代谢物对病原菌抑制率为 50%，可见两种微生物相互作用产生了特异的抗菌物质[41]。棘孢木霉GDFS1009与解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensACCC11060混合培养，液相色谱-质谱检测结果表明，共培养液中吲哚-3-乙酸、吲哚-3-羧酸、苯丙胺、反式-3-香豆酸和反式肉桂酸等 5种抗菌物质的含量显著高于单一培养液，使其对灰霉病的抑菌效果显著提高[42]。哈茨木霉OMG16和贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisFZB42联合接种较单菌株接种可显著提高油菜叶片中乙烯和茉莉酸反应途径的转录水平，进而协同调节植株的生长并提高抗病性[43]。在接种病原菌的情况下，哈茨木霉 THU0816、铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaPHU094和中生根瘤菌MesorhizobiumRL091组成的复合菌剂能使鹰嘴豆叶片产生更多的莽草酸，其含量显著高于未处理和单菌株处理的植株，同时阿魏酸、丁香酸和槲皮素等酚类物质的含量也有所提高，这些物质均与植物系统抗性增加有关[44]。混合接种绿色木霉和枯草芽胞杆菌，可使芹菜中的过氧化氢酶和POD酶活性显著提高[45]。哈茨木霉、铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌混合接种于豌豆根际，可使植株体内脯氨酸和酚类物质积累量、PAL、POD和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等防御酶活性显著高于单菌处理[46]。不同微生物共培养的接种次序也会影响某些重要基因的启动。先接种木霉后接种芽胞杆菌可上调木霉菌中与孢子产生、次生代谢物合成、拮抗、植物生长促进相关酶和抗氧化剂相关基因的表达，而同时接种2菌株，以上基因表达均下调[47]。
基于木霉和生防细菌不同的防病机制，菌株复配后分别发挥自身直接抗菌作用，从而使综合抗病效果增强。在哈茨木霉VT9-3r和枯草芽胞杆菌VT4-1x配施防治马铃薯黑痣病的研究中，2种有益菌具有不同的生防作用，前者主要利用重寄生和竞争作用，后者主要分泌抗生物质，二者配施处理的病害防效高达81.5%，显著优于单菌株发酵液的防效[48]。哈茨木霉THSW13和铜绿假单胞菌BJ10-86共同作用于辣椒疫霉菌Phytophthoracapsici。其中，木霉发挥竞争、重寄生和抗生作用，铜绿假单胞菌产生大量铁载体，分泌氰化氢和氨等抑菌物质，将不能利用的Mn4+转变为可利用的Mn2+，提高对病原菌的抑菌能力。因此，施用这2种生防菌的混合菌剂，使病害抑制率达到73.2%，显著高于单菌菌剂[49]。
2.1.2 木霉与真菌的协同作用 木霉与其他有益真菌共同作用，或诱导真菌产生次生代谢产物，或激活植株免疫系统，在促进植物抗性方面表现出协同效果。Shobha等[50]采用气相色谱-质谱联用技术鉴定了不同木霉共培养形成的次生代谢产物，发现哈茨木霉PGT4、里氏木霉PGT5和PGT13共培养可生成十六烷酸、6,9-十八碳二炔酸甲酯等化合物，与木霉单菌株培养的代谢产物存在显著差异。在哈茨木霉和棘孢木霉共同作用下，辣椒植株中的阿魏酸、辣椒素和水杨酸的含量较单菌处理有所提升，其防御基因的表达量显著增加[51]。拟康氏木霉和黑根霉Rhizopusnigrican的混合发酵液可以提高黄瓜根茎和叶片中的PAL、SOD和POD等防御酶活性，使抑菌效果显著优于单菌发酵液[52]。绿色木霉和哈茨木霉混合发酵液处理较单菌株发酵液处理，黄瓜根际的枯萎病菌数量降低，幼苗鲜重有所增加[53]。豇豆根际同时接种哈茨木霉和球囊霉Glomusversiforme较单菌株接种处理，株高、根重和地上部分鲜重和干重均有所增加，豇豆白粉病病情指数显著降低[54]。温室盆栽试验表明，哈茨木霉和丛枝菌根真菌的单菌处理和联合处理都能促进番茄幼苗的生长和抗枯萎病能力，但是二者联用的效果最佳[55]。
2.1.3 木霉与其他微生物的协同作用 木霉和某些微生物相互作用能改善植株根际微生物群落结构，增强植物的防御能力。Li等[56]采用高通量测序技术定量研究了哈茨木霉 LTR-2对白菜根际菌群的影响，结果显示，接种LTR-2显著降低了白菜根肿病菌Plasmodiaphorabrassicae和致病性链格孢菌Alternaria、镰孢菌的丰度，同时显著增加土壤中芽胞杆菌的数量。施用哈茨木霉后，番茄根际土壤中细菌、真菌和放线菌数量显著增加，改善了植株根际土壤的微生态环境。除了木霉菌发挥抑菌作用外，土壤中增加的某些有益菌也对病原菌有一定的抑制作用，在其协同作用下，提高了植物的抗病能力，有效减轻了枯萎病害的发生[57]。土壤中有益菌的增加可能是因为木霉能与土壤中的某些有益微生物形成互利或偏利关系，如一类微生物的代谢产物是其他微生物的生存必需品，或者木霉对病原菌的抑制间接促进了其他有益微生物的生存和增殖，最终表现为根际微生物类群向有利于植株的方向转变，提高了植物对病害的抵御能力[58]。
2.2 木霉与化学农药的协同作用
木霉菌剂防治植物病害，既不会造成环境污染，也不易使病原菌产生抗性，但是见效普遍较化学农药慢。化学农药往往高效、便捷、持效期较短，但长期大量使用易导致病原菌产生耐药性。因此，按照取长补短的思路将生防木霉与适宜的化学药剂配施，可以发挥双方优势，使防治效果接近理想状态[59]。
2.2.1 木霉与化学农药的相容性 木霉与化学农药的相容性或对化学农药的抗性是决定二者能否发挥协同作用的关键[60]。在构建木霉和农药的组合时，应该先明确木霉对化学农药是否敏感，生防机制是否受农药影响，木霉可否降解或吸收该药剂。农用抗生素有效霉素A是好氧微生物分泌的一种次级代谢产物，可抑制菌体的正常生长，但其对棘孢木霉分泌的细胞壁降解酶活性和糖类、脂类代谢均无显著影响[61]。新农药克露和速克净在浓度为100 ppm时对木霉表现出较高的亲和性，当浓度增至600 mg/L及以上，2种农药与木霉具有高度不亲和性[62]。可见木霉与化学农药的相容性与化学农药的使用剂量有关。多种化学杀菌剂对生防木霉的毒力试验表明，啶酰菌胺、氟啶胺、嘧菌酯、咯菌腈和啶菌唑对番茄灰霉病菌的抑菌作用显著高于对木霉的抑制作用，而多菌灵、福美双、异菌脲、乙霉威、嘧霉胺对木霉的抑制作用高于对番茄灰霉病的抑制作用[63]。说明木霉对部分化学农药具有一定耐受性。一些木霉产生的胞外酶可以催化降解有毒化合物[64]。如绿色木霉和里氏木霉分泌的乙酰转移酶能降解农药残留物3,4-二氯苯胺[65]。这使得木霉与其他真菌相比具有与化学农药配施的优势。然而，农药种类繁多，作用机制复杂，不同农药与木霉的关系仍待深入研究。
2.2.2 木霉与唑类杀菌剂的协同作用 已有研究中，木霉与许多唑类化学杀菌剂表现出SDP作用，如多菌灵、丙环唑、三唑酮等。基于木霉与这些杀菌剂的相容性，二者复配应用于温室或大田环境呈现出比单独施用更好的防效。哈茨木霉菌剂与多菌灵按3:2配施，对水稻苗期立枯病菌的抑菌率最高，较单独处理分别提高 44.46%和 11.66%[66]。木霉复配多菌灵防治草莓灰霉病，按 17:3配比时，混合制剂的防治效果为85.9%，显著高于单因素处理[67]。木霉与三唑酮复配较单独使用木霉对辣椒白绢病菌、西瓜枯萎病菌的抑制率更高，且防治效果与木霉菌的用药量成正比[68,69]。庄敬华等[70]研究了几种土壤杀菌剂对木霉防治甜瓜枯萎病的影响，发现恶霉灵在田间使用浓度下与木霉菌具有显著的协同增效作用，对甜瓜枯萎病相对防效达79.27%，较单独使用恶霉灵或木霉菌分别提高了17.82%和63.24%。恶霉灵和棘孢木霉SCO12复配还能有效地控制豇豆枯萎病，且优于单独使用时的效果[71]。Abd-El-Khair等[72]探究了木霉和甲基硫菌灵对大豆枯萎病的防治效果，结果显示二者联用使植株体内POD、PPO和几丁质酶的活性显著高于单独处理。几丁质酶主要催化病原菌细胞壁的水解[73]，POD、PPO均是清除植物体内活性氧伤害的保护性酶[74]，从而大幅度提高了病害防效。哈茨木霉与戊唑醇的组合既能防治大蒜白腐病，又能促进植株生长，且复配处理的结果明显优于单独使用木霉或杀菌剂[75]。这主要得益于木霉的促植物生长作用，使植株更加健壮，避免或减轻了病害的发生[76]。在实际应用中选择喷施顺序对防治植物疾病也具有重要影响。哈茨木霉SH2303与苯醚康唑-丙环唑（DP）防治玉米叶枯病的田间试验表明，与对照相比，二者配施可显著减少叶部病斑面积。DP+SH2303和SH2303+DP顺序施用的处理均诱导植株相关防御酶的合成和水杨酸通路防御相关基因（PR1）的表达，但是DP+SH2303顺序施用对病原菌控制效果优于SH2303+DP顺序施用。可能是由于先喷施DP可直接杀死病原菌并诱导植物抗性启动，快速形成对病原菌的抑制，而木霉菌繁殖需要一定时间，其诱导植物产生系统抗性的时间较DP更长[77]。
2.2.3 木霉与其他杀菌剂的协同作用 有关木霉与其他杀菌剂复配的抑菌效果有部分报道。有效霉素A是一种氨基糖苷类抗生素，可以减缓玉蜀黍丝核菌Rhizoctoniazeae菌丝体在玉米叶片上的生长并导致菌丝畸形。当有效霉素A与生防木霉配施时，该丝核菌的生长完全受到抑制，但木霉菌并未受到显著影响[78]。有效霉素A能抑制真菌细胞壁中的海藻糖酶活性，干扰菌丝内养分的运输，从而抑制真菌的生长和发育[79]。然而，该物质对木霉的海藻糖代谢系统并无显著影响[78]。因此，木霉与此类药剂能充分发挥协同抑菌作用。嘧菌胺，嘧啶胺类杀菌剂。该杀菌剂对灰霉病菌具有较强的抑菌能力，对木霉有良好的亲和性[80,81]。啶酰菌胺是烟酰胺类杀菌剂，在含啶酰菌胺的平板上对峙培养哈茨木霉和番茄灰霉病菌，可导致病菌菌丝间断性溶解。哈茨木霉对该药剂有一定耐受性，其产生的挥发性物质使抑菌效果显著高于未含啶酰菌胺的处理[82]。代森锰锌属于有机硫杀菌剂。在生防菌里氏木霉 C2A对镰孢菌的抑菌能力检测中，培养基添加低浓度（0.1 mg/mL）代森锰锌的抑菌率较未添加提高约36%，可见里氏木霉与代森锰锌联用在抑制植物病原菌方面具有 SDP作用[83]。甲基立枯磷为低毒的硫酮磷酸酯类有机磷杀菌剂，对多种担子菌、子囊菌和半知菌具有杀菌抑菌作用。研究表明，不同的真菌对其耐受浓度具有差异，哈茨木霉的耐受浓度是400 mg/L，致病性尖镰孢菌F.oxysporum、层生镰孢菌F.proliferatum和枝顶孢霉Acremoniumstrictum分别为450、550和250 mg/L。在对峙培养中，哈茨木霉对3种病原菌的抑制率为77.3%～78%，而添加甲基立枯磷（终浓度200 ppm）使其抑制率增至85%～100%[84]。可见，在低浓度甲基立枯磷环境中，木霉仍能发挥一定拮抗作用，使二者联用形成更强的抑菌效果。以上研究说明，部分木霉菌与杀菌剂合理复配能提高防病效果，但是相关机理以及大田生产条件下的可行性仍待进一步研究。
2.3 木霉与营养物质的协同作用
营养物质在植物土传病害生防体系中扮演着重要角色，不仅决定着植物的生长情况，还直接影响植株的抗逆性和抗病性。同时，环境中适宜的营养种类及浓度能够促进微生物的生长繁殖，使其具备更强的生存能力和竞争力。
2.3.1 木霉与无机营养物质的协同作用 研究表明，营养物质能够促进木霉菌丝的生长，增加其在土壤中的定殖数量，从而增强其生防作用。在氮、磷、钾肥和不同营养元素对木霉菌定殖数量影响的研究中，钾肥对木霉菌丝生长具有显著刺激作用，锰、铜和钾等营养元素可明显促进木霉在甜瓜根际的生长繁殖[85]。庄敬华等[86]研究表明，钼酸铵、硫酸亚铁、硫酸钙及磷酸二氢钾对木霉菌丝生长及孢子形成具有明显刺激作用，将其作为木霉菌剂的添加剂能显著降低甜瓜枯萎病的病情指数。随着培养基中氯化铵、硫酸钾和七水硫酸亚铁3种营养物质浓度的增加，木霉产孢率逐渐增加，当浓度超过一定值后，孢子得率开始降低[87]。可见二者联合应用于生产中，应适当控制营养物质的用量。
2.3.2 木霉与有机营养物质的协同作用 有机肥能快速增加土壤有机质含量，调节土壤pH值，促进土壤酶活性，有效改善土壤微生物群落结构，抑制病原菌的繁殖[88-90]。因此，木霉菌配施有机肥往往对作物病害具有更好的防治作用。如香菇菌糠能显著提高木霉对黄瓜枯萎病的防治效果[91]。哈茨木霉M-33与小麦秸秆的配施处理能影响马铃薯土壤微生物类群，降低镰孢菌的相对丰度，提高细菌、放线菌和木霉菌的相对丰度，对马铃薯黑痣病的防效高达70.26%，显著高于对照组[92]。有研究表明，以马粪6 kg/m2处理土壤，白绢病菌Sclerotiumrolfsii的死亡率为32.5%，而马粪与哈茨木霉联合施用于土壤后，白绢病菌死亡率达到了 100%[93]。
以上田间试验均侧重于不同施用方案对病害的防治效果，并未阐明增施营养物质对木霉菌本身及植物根际环境影响的具体机制。鉴于不同作物和耕作环境的复杂关系，木霉与营养物质之间的SDP作用亟待综合运用分子生物学、土壤生态学和植物营养学等知识对其进行深入探究。
深入开展木霉与其他生物或非生物协同机制的研究，能够促进微生物制剂合理使用、协同增效，最大化利用土壤中的养分，改善土壤微生物群落结构，有助于解决农业生产中土壤微生态失衡的问题。目前，关于木霉的SDP机制研究和应用研究有待在以下几方面开展工作：（1）木霉与其他微生物共培养的代谢物与单培养时差异很大，应探明复杂的差异代谢物的来源及代谢途径。（2）木霉与其他微生物共培养导致木霉的部分基因被激活，其激活机制尚不清楚。（3）诸多学者对SDP关系中木霉等微生物的有效性进行了评估，但是微生物之间以及微生物与环境之间的互作关系复杂，尤其在功能级别上的互作研究较少，这将成为今后研究的主要内容。（4）木霉与化学药剂的SDP研究多为室内培养或盆栽水平，其田间应用的有效性及稳定性研究亟待开展。（5）木霉与化学肥料混合施用现象客观存在且较为普遍，其联合作用机制及其对病害的长期防控效果有待探索。随着对木霉菌的深入研究和现代技术的发展，有关木霉和其他生物、非生物因素的多种SDP机制将逐渐被揭示，将提高人类对木霉以及相关微生物的高效生物防治的认识，为新型生防菌剂的开发利用提供更加坚实的理论支撑。
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