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武菲菲，徐臣年，金 屏，翟蒙恩，乔 锐，郭 红
心肌纤维化(MF)是常见的心血管病理生理表现，具体机制尚不明确，研究认为MF可能成为多种疾病治疗的有效靶点[1-4]。研究表明，Notch信号通路是机体生长发育的关键分子，其介导的相关凋亡及自噬与MF、心肌损伤关系密切[5-7]。目前MF治疗尚缺乏有效策略，中药提取物熊果苷(AR)具有较强的抗氧化应激、抗炎作用，可通过不同机制修复组织损伤[8-11]。本研究采用异丙肾上腺素(ISO)诱导MF小鼠模型，探讨AR对MF的改善作用及对Notch1/NRG1信号通路的调控作用。
1.1实验动物及试剂 实验动物选择6周龄健康雄性C57/BL小鼠80只，体质量(20.12±1.45)g，购自空军军医大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(陕)2019-001。Fas、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Notch1、NRG1、GAPDH抗体、AR购于美国Sigma公司；
ISO购于天津泰泽兴业生物科技有限公司。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、结缔组织生长因子(CTGF)试剂盒购于美国R&D Systems公司。
1.2研究方法
1.2.1分组及模型建立：80只小鼠按随机数字表法分为对照组(Sham组)、心肌纤维化组(MF组)、AR处理组(AR+MF组)和AR联合Notch1抑制剂(DAPT)处理MF组(AR+DAPT+MF组)，每组20只。MF组、AR+MF组、AR+DAPT+MF组于小鼠肩胛间皮下注射ISO(7 mg/kg、3/d)，重复给药持续15 d，Sham组于同一部位注射相同体积生理盐水。AR+MF组腹腔注射AR 10 mg/(kg·d)，AR+DAPT+MF组腹腔注射AR 10 mg/(kg·d)及DAPT 10 mg/(kg·d)，重复给药持续15 d。
1.2.2ELISA法检测小鼠血清TNF-α、CTGF水平：各组小鼠经2%异氟烷麻醉后，固定，剪开并剥离小鼠颈部皮肤、皮下组织，暴露颈动脉，以组织剪剪开快速取血2 ml至EP管中，3000 r/min离心15 min，取上层血清。按照TNF-α、CTGF检测试剂盒说明书检测。
1.2.3心脏超声检测小鼠心功能：各组小鼠经2%异氟烷麻醉后四肢固定超声仪电极，探头在乳头肌水平位置用M型取样线检测，测量并计算左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期前壁厚度(LVAWd)。
1.2.4天狼猩红、Masson染色检测小鼠心肌组织纤维化程度：达实验终点后，各组小鼠经2%异氟烷麻醉后迅速剪下心脏，冷PBS液冲洗3遍，以多聚甲醛(40 g/L)固定72 h，石蜡包埋、切片，行天狼猩红、Masson染色，在光学显微镜下拍摄天狼猩红、Masson染色后图像并保存。
1.2.5qPCR检测小鼠心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达量：用Trizol试剂从组织中分离总RNA，逆转录生成cDNA，用BIO-RAD分光光度法测定RNA和cDNA浓度和纯度，Primer Premier 6.0软件设计引物并合成。在iQTM5 RT-PCR系统中行PCR扩增，采用2-ΔΔCt法测定Fas、Caspase-3 mRNA表达量。
1.2.6TUNEL染色检测小鼠心肌凋亡水平：按TUNEL试剂盒说明书将各组小鼠心肌组织石蜡切片染色，荧光显微镜下拍照，每张切片随机选取10个高倍视野观察。染色每个阳性点作为一个细胞计数，与之重叠的绿点计数为凋亡细胞，凋亡细胞数除以总细胞数得出凋亡指数。
1.2.7Western blot法检测凋亡相关蛋白表达：各组小鼠取相同质量心肌组织放入离心管中，加入预冷PBS液，剪碎心肌组织，4 ℃ 3000×g离心10 min，弃上清，沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA强裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4 ℃ 12 000×g离心30 min，取上清。电泳并用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，裁剪目的条带，放入对应Notch1(1∶1000)、NRG1(1∶1000)、Fas(1∶1000)、Bcl-2(1︰1000)、Bax(1︰1000)、Caspase-3(1︰1000)和GAPDH抗体(1︰5000)中，4 ℃摇床孵育过夜；
TBST洗脱3次，每次5 min，将目的条带放入山羊抗兔或抗鼠二抗(1︰5000)中室温摇床孵育2 h，TBST洗脱3次，每次5 min，ECL化学发光液避光检测统计灰度值。
2.1DAPT能阻断AR改善MF所致心功能障碍及心肌损伤 与Sham组比较，MF组心功能明显降低，LVEF、LVFS显著减小，LVAWd明显增大(P<0.05)；
与MF组比较，AR+MF组LVAWd明显减小，LVEF、LVFS明显增加(P<0.05)；
与AR+MF组比较，AR+DAPT+MF组LVEF、LVFS及LVAWd明显降低或减小(P<0.05)。见表1。
表1 各组小鼠心功能心脏超声检测结果比较
与Sham组比较，MF组血清TNF-α、CTGF水平及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达明显增加(P<0.05)；
与MF组比较，AR+MF组血清TNF-α、CTGF水平及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达明显降低或减少(P<0.05)；
与AR+MF组比较，AR+DAPT+MF组血清TNF-α、CTGF水平及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达明显增加(P<0.05)。见表2。
表2 各组小鼠血清TNF-α、CTGF及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA相对表达量比较
2.2DAPT可阻断AR改善MF心肌结构和纤维化 Sham组小鼠心肌组织纤维排列整齐，无纤维化，胶原含量低；
MF组可见细胞核多逸出，心肌结构排列紊乱，肌纤维断裂明显，胶原含量高；
与MF组相比，AR+MF组肌纤维排列整齐，纤维化程度改善，胶原含量降低；
与AR+MF组相比，AR+DAPT+MF组心肌纤维化程度明显增加，排列紊乱，胶原含量增高。见图1。
图1 各组小鼠心肌组织纤维化程度天狼猩红、Masson染色结果(×400)
2.3AR能抑制MF所致心肌细胞凋亡及DAPT阻断AR的作用 心肌组织TUNEL染色结果表明，与Sham组比较，MF组心肌组织TUNEL阳性染色数量明显增加；
与MF组比较，AR+MF组TUNEL阳性染色数量明显减少；
与AR+MF组比较，AR+DAPT+MF组TUNEL阳性染色数量显著增加。见图2。
图2 各组小鼠心肌细胞凋亡情况
Western blot法检测结果显示，与Sham组比较，MF组心肌组织中Notch1、NRG1、Bcl-2表达量明显降低，Fas、Caspase-3、Bax表达量增加(P<0.05)；
与MF组比较，AR+MF组心肌组织Notch1、NRG1、Bcl-2表达量明显升高，Fas、Caspase-3、Bax表达量降低(P<0.05)；
与AR+MF组比较，AR+DAPT+MF组心肌组织Notch1、NRG1、Bcl-2表达量降低，Fas、Caspase-3、Bax表达量增加(P<0.05)。见表3。
表3 各组小鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达量比较
MF是由多种因素引起的，这些因素可导致胶原纤维过度沉积，胶原浓度显著增强，心肌胶原类型和结构排列紊乱[12-14]。研究表明，MF、心血管疾病及环境之间存在着密切而复杂的关系[15-17]。MF是心肌重构的主要病理基础，也是心律失常、心力衰竭等心血管事件的潜在危险因素[18-20]。研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统、趋化因子、内皮素-1和血小板衍生生长因子与MF密切相关[21]。然而近年研究表明凋亡、自噬在MF中起着重要作用[22-23]。然而凋亡、自噬与MF的作用机制尚不十分清楚，凋亡与自噬的调节可能成为治疗MF的潜在目标。
本研究结果发现，MF与Notch1/NRG1通路介导的细胞凋亡有关，同时AR可激活Notch1/NRG1通路抑制细胞凋亡。结果一定程度阐明了MF的作用机制，并可能辅助探寻预防和治疗MF的靶点。Notch信号与血管发育、内环境稳定和炎症反应相关[24]。Notch通路在细胞凋亡过程中调节细胞自我更新、组织生长发育[25-26]。Notch1信号传导的下游基因包括NRG1和HRT，Notch1激活抑制心肌细胞凋亡，Notch1/NRG1通路在心血管系统细胞增殖、修复中起关键作用。Notch1和NRG1已证明能通过多种途径抑制细胞凋亡、促进细胞存活以保护心脏结构和功能[24]。Notch1直接靶向NRG1，AR可能通过激活NRG1在MF模型中发挥保护作用。AR本身具有抗氧化、抗凋亡等作用，然而AR对ISO所致心肌细胞凋亡的调控作用有待进一步研究。本实验结果表明，在MF模型中，Notch1和NRG1表达均下调，而AR组Notch1和NRG1表达恢复。DAPT是Notch1抑制剂，可通过阻断Notch1减弱AR对MF的改善作用。故通过抑制Notch1/NRG1通路，部分消除AR对ISO所致MF心肌组织的保护作用。DAPT还可部分消除AR通过Notch1/NRG1通路对心肌细胞凋亡的影响。总的来说，AR可通过激活Notch1/NRG1通路发挥心肌保护作用。
尽管如此，凋亡在MF及不同疾病不同发病阶段的具体作用机制尚不清楚，凋亡、MF及二者间的关系仍需深入研究与探索。本研究阐明了AR对ISO所致MF心肌细胞凋亡的保护机制，发现MF与Notch1/NRG1通路介导的心肌细胞凋亡有关，同时AR激活Notch1/NRG1通路可抑制细胞凋亡。
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